海马 APOE/S1P 轴调控自闭症小鼠模型中的突触与行为缺陷

《Neurobiology of Disease》：Hippocampal APOE/S1P axis regulates synaptic and behavioral deficits in a mouse model of autism

　　

自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种发病机制不明的神经发育性疾病。突触病理是其核心特征，但关键的分子调控因子尚不清楚。脑内主要的载脂蛋白 APOE（Apolipoprotein E）可转运包括 S1P（Sphingosine-1-phosphate，1-磷酸鞘氨醇）在内的脂质以调节神经元功能；然而 APOE/S1P 轴在 ASD 中的作用尚不明确。研究人员发现 ASD 患儿血清中 APOE 与 S1P 均升高。在 BTBR 小鼠海马中二者亦升高，且 APOE 在神经元上出现异常聚集。为验证因果关系，研究人员开发了脑靶向纳米胶束（MAN@SKI II）以抑制海马 S1P。MAN@SKI II 降低了 APOE/S1P 水平，重新激活 PI3K/Akt/mTOR 通路，修复突触超微结构，并改善 BTBR 小鼠的社交与认知行为。上述结果表明，APOE/S1P 轴与 ASD 中海马突触病理及行为缺陷相关，提示其可作为治疗干预的潜在机制性靶点。

海马 APOE/S1P 轴调控自闭症小鼠模型突触与行为缺陷的研究解读

研究背景与立题依据

自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）以社交缺陷、重复刻板行为和受限兴趣为核心临床表现，突触功能异常被认为是其核心病理特征之一，海马作为学习记忆的关键脑区在 ASD 中被报道存在结构与功能损害。尽管 SHANK3、SCN2A、NLGN 等突触基因变异被证实影响突触稳定性，但直接靶向突触缺陷的治疗手段仍匮乏。载脂蛋白 E（Apolipoprotein E, APOE）是脑内最丰富的载脂蛋白，可通过 ABCA1/ABCG1 介导磷脂与胆固醇转运并影响神经元存活，既往关联研究显示 APOE 高甲基化及 ε2/ε4 等位基因与 ASD 存在联系；1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate, S1P）是鞘脂代谢核心分子，可通过 S1P 受体（S1PR_1–5）调控神经迁移、突触成熟及胶质功能，ASD 患者血清及代谢模型中 S1P 升高。APOE 可通过 ABCA1 装载 S1P 进行细胞间转运，S1P 失衡亦可反向影响 APOE 脂质化，二者构成功能性 APOE/S1P 轴，但其是否在 ASD 中海马突触功能障碍中发挥协同作用尚未见报道。本研究以临床样本联合 BTBR T⁺Itpr3^tf/J（BTBR）自闭症小鼠模型，探究 APOE/S1P 轴在 ASD 海马突触病理及行为异常中的作用及干预价值。论文发表于《Neurobiology of Disease》。

主要关键技术方法

研究人员采集 ASD 患儿及典型发育（Typically Developing, TD）儿童血清检测 APOE 与 S1P 水平，并以社交反应量表（Social Responsiveness Scale, SRS）评估症状严重程度；选用 BTBR 雄鼠为 ASD 模型、C57BL/6 J 雄鼠为对照，尾静脉给予甘露糖修饰、负载 S1P 抑制剂 SKI II 的纳米胶束（MAN@SKI II，40 mg/kg，连续 7 d）实现 GLUT1 介导的脑靶向递送，设 Vehicle 处理 BTBR 模型组及 C57 对照组；采用三箱社交实验、自我理毛实验、埋珠实验、旷场实验及莫里斯水迷宫评估社交、重复刻板及空间学习记忆行为；取海马组织通过 ELISA 检测 APOE 与 S1P 含量，Western blot 检测突触蛋白（PSD95、Synapsin I、GAP43、RAC1/2/3、BDNF）及 PI3K/Akt/mTOR 通路磷酸化水平，qRT-PCR 检测 mRNA 表达，免疫荧光与 Nissl 染色观察神经元形态与 APOE 定位，透射电镜观察突触数目、突触后致密区（Postsynaptic Density, PSD）长度及线粒体数目，生化法测乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）与谷氨酸（Glutamate, Glu）；并行海马组织 RNA-seq 进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）筛选及 GO/KEGG 富集分析。

研究结果

3.1. The APOE/S1P axis is dysregulated in ASD human sera and the BTBR hippocampus, and is associated with neuronal impairment

ASD 患儿血清 APOE 与 S1P 显著升高，血清 S1P 水平与 SRS 总分正相关，APOE 无此相关性；BTBR 小鼠海马 APOE mRNA 与蛋白及 S1P 含量均高于 C57 对照，免疫荧光显示 BTBR 海马组织 APOE 在神经元上异常聚集并与 NeuN 共定位增加，原代海马神经元中 APOE 向膜区重分布致与核标记物共定位下降；BTBR 原代神经元 MAP2 荧光强度降低、总树突长度缩短，且 APOE 水平与 MAP2 表达负相关，提示 APOE/S1P 轴失调伴随神经元突起生长受损。

3.2. MAN@SKI II ameliorates ASD-like behaviors in BTBR mice

MAN@SKI II 干预后 BTBR 小鼠自我理毛时间与频次降低、埋珠数减少，提示重复刻板行为减轻；旷场实验中总运动距离与累积活动时间下降；三箱实验中社交指数（陌生鼠 vs 空笼）与社会新颖性指数（新陌生鼠 vs 熟悉陌生鼠）均升高，提示社交互动与社会新颖性偏好恢复；莫里斯水迷宫训练期逃避潜伏期缩短，探针实验平台穿越次数增加，提示空间学习与记忆改善。

3.3. MAN@SKI II alleviates neuronal damage in the hippocampus of BTBR mice and modulates the APOE/S1P axis

BTBR 小鼠海马 DG 与 CA1 区 Nissl 染色示分层增厚但神经元密度下降，NeuN 阳性面积与神经元数减少；MAN@SKI II 处理后上述改变被部分逆转。治疗后海马 S1P 含量下降，APOE mRNA 与蛋白下调，DG 区 APOE 与 NeuN 共定位降低，LRP1B（Low-density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1B）表达亦下调，表明 MAN@SKI II 可调节海马 APOE/S1P 轴并减轻神经元丢失。

3.4. MAN@SKI II improves synaptic structure in the hippocampus of BTBR mice

BTBR 小鼠海马突触相关基因（PSD95、Synapsin I、GAP43、RAC1/2/3、BDNF）mRNA 与蛋白表达下调，MAP2 荧光强度减弱；电镜示突触数目减少、PSD 长度缩短、线粒体数目减少；ACh 降低、Glu 升高。MAN@SKI II 处理后突触数目、PSD 长度及线粒体计数回升，突触蛋白表达恢复，ACh 与 Glu 水平趋于正常，提示突触超微结构与神经递质平衡获改善。

3.5. MAN@SKI II activates PI3K/Akt/mTOR pathway via APOE/S1P axis to improve synaptic deficits

海马 RNA-seq 示 Model 组 vs Con 组 980 个 DEGs，MAN@SKI II 组 vs Con 组 312 个 DEGs，GO 富集涉及脂质分解代谢、脂肪酸转运调控及激酶活性，KEGG 富集于 PI3K-Akt 信号通路、轴突导向与鞘脂代谢通路；Western blot 显示 BTBR 小鼠海马 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值降低，MAN@SKI II 处理后磷酸化水平回升，提示抑制 S1P 并纠正 APOE/S1P 轴可激活 PI3K/Akt/mTOR 通路并改善突触缺陷。

讨论与结论（翻译研究结论部分）

本研究表明，APOE/S1P 轴在 ASD 患儿血清及 BTBR 小鼠海马中失调。使用脑靶向纳米胶束（MAN@SKI II）抑制 S1P 并使该轴恢复正常，可减轻 ASD 样行为、缓解海马神经元与突触缺陷，并重新激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路。这些发现提示 APOE/S1P 轴参与 ASD 小鼠模型的海马功能障碍，靶向该轴具有治疗潜力。ASD 患儿血清 APOE 轻度但持续升高（约 2.5 ng/mL，p < 0.05）与 S1P 显著升高共同支持 APOE/S1P 轴失调；外周 APOE 与 SRS 评分不相关（ρ = 0.1261, p = 0.3457），提示其为易感/特质标志物，而 S1P 与 SRS 正相关（ρ = 0.4343, p = 0.0007），更贴近行为表型。BTBR 小鼠海马 APOE 升高伴神经元损伤，将区域性 APOE 失调与海马细胞损伤相联系。突触缺陷可能源于异常 APOE 聚集与 S1P 信号紊乱协同作用（即 APOE/S1P 轴破坏），APOE–S1P 复合物可能干扰 S1P 受体结合从而阻碍下游 PI3K/Akt/mTOR 正常激活；升高 S1P 亦可刺激星形胶质细胞释放更多 APOE 形成恶性循环。SKI II 降低 S1P 同时下调 APOE，证实二者相互依赖。MAN@SKI II 经 GLUT1 介导跨越血脑屏障，克服游离 SKI II 脑穿透差与溶解性差的问题。转录组鉴定到轴突导向（如 Dpys、Gabra6）与细胞骨架（如 Snai3、Mir1897）相关基因异常并可被治疗逆转。PI3K/Akt/mTOR 通路在 BTBR 小鼠受抑，MAN@SKI II 使其磷酸化水平回升。局限性在于临床血清数据为相关性且未直接检测人脑 APOE/S1P，动物实验仅用雄性 BTBR 小鼠。综上，本研究通过临床—动物多层次证据阐明 APOE/S1P 轴与 ASD 海马突触病理及行为异常的关联，脑靶向抑制 S1P 可改善突触与行为缺陷并伴随 PI3K/Akt/mTOR 再激活，支持 APOE/S1P 轴作为 ASD 潜在治疗靶点与未来生物标志物来源。