《Neurobiology of Disease》：A phenylketonuria mouse model exhibits EEG spike-wave discharges: Effects of sleep deprivation and low-Phe diet
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苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU) 是一种遗传性代谢疾病，以苯丙氨酸羟化酶 (phenylalanine hydroxylase, PAH) 缺乏及血液和脑中苯丙氨酸 (phenylalanine, Phe) 水平升高为特征，导致神经毒性和
苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU) 是一种遗传性代谢疾病，以苯丙氨酸羟化酶 (phenylalanine hydroxylase, PAH) 缺乏及血液和脑中苯丙氨酸 (phenylalanine, Phe) 水平升高为特征，导致神经毒性和脑功能障碍。升高的 Phe 水平可能改变脑活动，因为饮食控制不佳与异常脑电图 (electroencephalogram, EEG) 相关。然而，关于这些电生理特征的知识仍然有限。本研究对 PAHenu2 小鼠进行了 EEG 记录以观察脑活动，该小鼠具有升高的 Phe 水平，类似于未治疗的 PKU 患者。EEG 记录显示频繁的自发棘慢波放电 (spike-wave discharges, SWDs) ，主要发生在清醒期和快速眼动 (rapid-eye-movement, REM) 睡眠期，并伴有肌张力降低。此外，SWD 发生率因睡眠剥夺而加剧，并在恢复睡眠期间恢复正常。虽然总睡眠量未改变，但 PKU 小鼠表现出更碎片化的睡眠，以及睡眠剥夺后 EEG 慢波活动反弹轻度改变。值得注意的是，通过饮食治疗降低血液 Phe 水平可减少基线条件下的 SWD 活动，但仅能部分预防睡眠剥夺期间升高的 SWD 表达。总之，本研究在 PAHenu2 小鼠模型中证明极高的 Phe 水平可导致异常脑活动，包括 SWDs 的发生。此外，研究结果表明 SWD 表达可通过限制 Phe 摄入而降低。
**苯丙酮尿症小鼠模型脑电异常活动及其调控机制研究解读**
苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU）是一种常染色体隐性氨基酸代谢疾病，由 PAH 基因突变导致苯丙氨酸羟化酶 (phenylalanine hydroxylase, PAH) 活性降低或缺失，引起苯丙氨酸 (phenylalanine, Phe) 代谢障碍。全球患病率约为每10万例活产儿6例。升高的 Phe 通过大氨基酸转运蛋白-1 (large amino acid transporter-1, LAT1) 竞争性地穿过血脑屏障，导致脑内 Phe 蓄积及其他氨基酸获取减少，影响多巴胺、5-羟色胺等神经递质合成，最终造成神经毒性及脑功能障碍，表现为认知缺陷、情绪障碍甚至癫痫等。尽管临床已报道 PKU 患者存在异常脑电图 (electroencephalogram, EEG) 信号和癫痫发作，但由于血 Phe 控制水平、个体代谢差异等因素，这些电生理改变的特征尚不十分清楚。此外，PKU 患者的睡眠脑电研究亦呈现不一致结果。为此，研究人员利用 PAHenu2 小鼠模型开展系统研究，旨在阐明高 Phe 水平对脑电活动及睡眠-觉醒模式的影响，并评估低 Phe 饮食干预的效果。该研究成果发表于《Neurobiology of Disease》。
**关键技术方法**
研究采用雄性 PAHenu2 小鼠及其野生型 (wild-type, WT) 同窝仔鼠作为样本队列，小鼠饲养于12小时光暗循环环境中。研究人员通过无线便携式 Neurologger 2A 设备（含三轴加速度计）进行连续 EEG/EMG 记录，后经 Somnivore 机器学习算法完成睡眠分期（NREM 睡眠、REM 睡眠、觉醒状态）。棘慢波放电 (spike-wave discharges, SWDs) 采用半自动化离线检测结合人工验证。睡眠剥夺采用温和刺激法（手套轻触、笼具轻晃等）在光照期前6小时实施。血 Phe 水平通过干血斑-高效液相色谱串联质谱 (HPLC-MS/MS) 检测。低 Phe 饮食干预将标准 AIN-93M 饲料（140 g/kg 酪蛋白）更换为含25%酪蛋白和75%无 Phe 氨基酸混合物的饲料，急性干预2天后进行 EEG 记录。
**研究结果**
**PKU 小鼠 SWD 特征及其与觉醒状态的关系**
研究人员首先确认 PKU 小鼠血 Phe 水平约为 WT 对照的32倍。在体 EEG 记录发现，PKU 小鼠出现大量高幅 EEG 棘波信号，其形态为尖锐负相棘波后跟随慢波成分，符合 SWD 特征，而 WT 小鼠完全缺失该模式。频谱分析显示 SWD 具有两个明显峰频率：8.2 Hz（δ-θ频段）和17.0 Hz（β频段），呈谐波关系，与失神癫痫动物模型相似。EMG 分析表明 SWD 发作伴随肌张力显著降低。就觉醒状态分布而言，SWD 主要发生于觉醒期和 REM 睡眠期，NREM 睡眠期发生概率较低，且 SWD 发作后动物多维持原状态，不引起显著的睡眠-觉醒状态转换。
**睡眠剥夺促进 PKU 小鼠 SWD 发生**
研究人员进一步探究睡眠剥夺对 SWD 的影响。基线条件下，SWD 数量呈现昼夜节律，暗期（小鼠主要活动期） hourly SWD 数量最高，光期最低。6小时睡眠剥夺期间， hourly SWD 显著增加，恢复睡眠后迅速回归基线水平，且睡眠剥夺未产生持久效应。值得注意的是，SWD 增加与睡眠剥夺时长无显著相关性，亦与温和刺激次数无关，提示 SWD 诱发可能与强制觉醒状态本身而非特定时间或机械刺激相关。
**PKU 小鼠睡眠-觉醒模式及睡眠结构特征**
PKU 与 WT 小鼠在总睡眠时间及 NREM、REM、觉醒三状态的百分比均无显著差异。但 PKU 小鼠睡眠更为碎片化：NREM 睡眠 episode 数量增多，REM 睡眠 episode 时长缩短，觉醒 episode 更短且更频繁。睡眠剥夺后，两组均出现睡眠反弹，但 PKU 小鼠觉醒 episode 时长未如 WT 般缩短，NREM 和 REM 睡眠 episode 数量亦未减少。就睡眠稳态指标而言，NREM 睡眠慢波活动 (slow-wave activity, SWA) 在睡眠剥夺后 PKU 小鼠呈现较弱的反弹反应，尤为光期早期（第7、9、10小时）与 WT 差异显著，提示 PKU 小鼠睡眠稳态调节轻度受损。
**低 Phe 饮食治疗减少 PKU 小鼠 SWDs**
急性低 Phe 饮食干预2天后，PKU 小鼠血 Phe 水平显著下降，基线条件下 SWD 活动显著减少。睡眠剥夺期间 SWD 升高趋势在低 Phe 饮食后有所减弱，但未达统计学显著性，表明饮食干预仅能部分预防睡眠剥夺条件下的 SWD 过度表达。
**讨论总结**
研究人员指出，PAHenu2 PKU 小鼠模型首次被证实存在异常 SWD 脑电活动，其特征与失神癫痫动物模型高度相似，提示临床 PKU 患者报告的异常 EEG 可能包含未被识别的 SWDs。该模型小鼠未表现明显认知缺陷，与部分仅有脑电改变而无严重认知障碍的 PKU 患者情况相符。低 Phe 饮食可降低 SWD 发生率，为成年期 PKU 患者的饮食干预提供了实验依据，与临床晚期诊断患者经饮食治疗后 EEG 改善的证据一致。但急性干预的效应是否持久、长期 Phe 升高及干预对 SWD 的影响尚需深入研究。
SWD 在睡眠剥夺期间持续升高的机制可能与觉醒状态本身相关，而非睡眠压力累积或刺激频率终成收频拟。PKU 小鼠 SWD 主要始于觉醒期和 REM 睡眠期，与典型失神癫痫模型中 NREM 睡眠期好发不同，研究人员推测这与觉醒期和 REM 睡眠期丘脑-皮层环路的高频、低幅、去同步化活动状态有关，提示 PKU 小鼠 SWD 可能源于丘脑-皮层环路的病理性共振。
睡眠方面，PKU 小鼠表现为碎片化增加但总体架构正常，这与前期红外传感器检测到的活动模式相一致，但并未完全复制此前发现的昼夜节律偏移，提示 PKU 小鼠非活动期可能处于安静觉醒而非真正睡眠状态。睡眠剥夺后的 SWA 反弹减弱可能反映睡眠压力累积不足或神经元同步化能力受损。
**研究结论**
本研究观察到 PKU 小鼠在觉醒期和 REM 睡眠期尤为突出地表现出 SWDs，其发生因睡眠剥夺加剧并在恢复睡眠后正常化。PKU 小鼠睡眠更为碎片化，睡眠剥夺后 SWA 反弹降低。 importantly，通过低 Phe 饮食降低 Phe 水平可直接减少非睡眠剥夺条件下的 SWD 发生，对睡眠剥夺条件下的升高亦有降低趋势但未达显著。这些发现深化了对 PKU、神经元活动改变、睡眠模式与 SWD 表达之间相互关系的理解，为探究丘脑-皮层通路起源及未来的饮食干预研究奠定了基礎。
