来自携带MC38和CT26肿瘤的小鼠肿瘤组织通过免疫组织化学（IHC）、免疫...进行分析

《Cancer Research Communications》：Tumor tissues from MC38- and CT26-bearing mice were analyzed by IHC, immuno... Open Access

　　

免疫检查点抑制剂（ICI）在部分结直肠癌中提供持久应答，但获益主要局限于微卫星不稳定性高（MSI-H）肿瘤。研究人员研究了肿瘤穿透肽iRGD是否增强抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）治疗疗效，并检测了神经纤毛蛋白1（NRP1）表达的临床相关性。同源小鼠模型（MSI-H MC38和微卫星稳定CT26）接受抗PD-1抗体和iRGD治疗。使用NRP1敲除的结直肠癌细胞系比较肿瘤细胞和基质NRP1的贡献。通过免疫组织化学（IHC）分析110例接受根治性手术的III期结直肠癌患者的连续队列中NRP1表达。iRGD和抗PD-1抗体联合治疗在两种结直肠癌模型中均增强抗肿瘤效应，伴随瘤内CD8⁺ T细胞丰度增加和功能改善。这种效应在缺乏肿瘤细胞NRP1的肿瘤中仍然存在，表明基质NRP1在介导iRGD活性中起关键作用。在结直肠癌患者的病理标本中，在肿瘤细胞、基质室和血管中观察到广泛的NRP1表达，表明基于iRGD的疗法在人类结直肠癌中具有潜在适用性。值得注意的是，基质NRP1表达与较差的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）相关。总之，这些发现将基质NRP1定位为预后标志物和基于iRGD的ICI策略的操作切入点，为临床开发以将ICI的益处扩展到更广泛的结直肠癌人群提供了强有力的依据。意义：研究人员证明iRGD增强了结直肠癌模型中抗PD-1治疗的疗效，改善了瘤内通透性和抗肿瘤免疫应答。NRP1在肿瘤各室中广泛表达，基质（尤其是内皮）NRP1是iRGD活性的关键介质，与不良预后相关，代表一个潜在的治疗切入点。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

结直肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管细胞毒性药物、分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICI）等全身疗法取得了显著进展，但不可切除或转移性患者的预后仍然较差。实体瘤（包括结直肠癌）治疗的关键挑战之一是治疗药物的肿瘤特异性有限和瘤内渗透性差。ICI（尤其是抗程序性细胞死亡蛋白1（抗PD-1）和抗程序性细胞死亡配体1（抗PD-L1）抗体）在部分癌症类型中可实现长期生存，但在结直肠癌中，临床获益主要局限于微卫星不稳定性高（MSI-H）肿瘤，仅占患者的一小部分。微卫星稳定型（MSS）结直肠癌对ICI的总体疗效仍然有限，因此亟需联合策略以增强治疗反应。肿瘤穿透肽iRGD（内化RGD）通过结合α_v整合素和神经纤毛蛋白1（NRP1），可促进共给药药物的选择性积累和深层渗透。iRGD已在多种临床前模型（尤其是与化疗联合）中展现效用，但其是否能增强ICI在结直肠癌中的疗效尚不清楚。此外，NRP1在肿瘤微环境中的表达分布及其预后价值存在争议。本研究旨在探讨iRGD能否增强抗PD-1抗体在结直肠癌同源小鼠模型中的疗效，并阐明NRP1的功能贡献及其临床相关性。该论文发表在《Cancer Research Communications》。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）构建同源小鼠模型（使用MSI-H MC38和MSS CT26细胞系），结合iRGD肽与抗PD-1抗体进行体内治疗实验；2）利用CRISPR-Cas9技术构建NRP1敲除（NRP1-KO）的MC38细胞株，比较肿瘤细胞与基质NRP1对药物递送和治疗反应的影响；3）通过Evans蓝染料渗透实验评估iRGD介导的肿瘤特异性药物积累；4）对110例来自京都大学医院行根治性手术的III期结直肠癌患者的连续队列进行免疫组织化学（IHC）分析，评估NRP1在肿瘤细胞、基质室及血管中的表达。所有动物实验经京都大学医学研究生院动物研究委员会批准，患者研究经伦理委员会批准并获知情同意。

**研究结果**

**iRGD enhances NRP1-dependent entry of a coinjected tracer into colorectal cancers**：通过全身渗透实验，研究人员发现iRGD联合给药显著增强了Evans蓝染料在MC38和CT26肿瘤中的选择性积累，而对正常组织无影响。抗NRP1抗体可抑制该效应，证实其NRP1依赖性。在NRP1-KO肿瘤中，iRGD介导的染料摄取仍有部分增加，提示基质NRP1的参与。

**iRGD potentiates the antitumor effect of anti–PD-1 antibody treatment in murine colorectal cancer models**：在MSI-H MC38和MSS CT26皮下肿瘤模型中，iRGD与抗PD-1抗体联合治疗组肿瘤体积和重量均显著小于抗PD-1单药组，且体质量未见明显变化，表明联合治疗增强抗肿瘤疗效且无额外毒性。

**Increased abundance of and functional alterations in intratumoral CD8⁺ T cells by iRGD and anti–PD-1 combination therapy**：免疫组化（IHC）和免疫荧光显示，联合治疗组瘤内CD8⁺ T细胞数量显著增加，且Ki-67⁺CD8⁺ T细胞（增殖标志物）和颗粒酶B⁺细胞（细胞毒效应标志物）比例升高。流式细胞术进一步证实CD8⁺ T细胞比例在CD45⁺免疫细胞中显著高于其他治疗组，而调节性T细胞比例无显著差异。

**Deleting NRP1 expression in colorectal cancer cells does not abolish the effects of iRGD/anti–PD-1 combination therapy**：在MC38-NRP1-KO肿瘤中，联合治疗仍呈现抑制肿瘤生长和重量的趋势。免疫荧光显示，NRP1-KO肿瘤中肿瘤细胞NRP1缺失，但CD31⁺血管内皮细胞中NRP1表达保留，暗示基质NRP1（尤其是血管相关）对iRGD作用至关重要。

**NRP1 is widely expressed in human colorectal cancer**：对110例患者肿瘤组织进行IHC分析，发现NRP1在肿瘤细胞、基质室和血管内皮细胞中均有广泛表达。肿瘤细胞中NRP1表达呈异质性；基质室中超过90%病例检测到NRP1，约45%呈中至强染色；血管内皮细胞表达模式与基质室相似。分层分析显示，NRP1在血管相关区域表达高于非血管的癌相关成纤维细胞（CAF）丰富区域。

**Stromal expression of NRP1 correlates with poor prognosis in colorectal cancer**：Kaplan–Meier生存分析显示，基质室NRP1高表达与较短的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著相关，而肿瘤细胞NRP1表达无显著关联。血管内皮细胞NRP1高表达也与较短OS相关。多因素Cox回归分析表明，基质NRP1高表达（HR=2.783，95%CI 1.040–7.452，P=0.042）和未接受辅助化疗（HR=2.634，95%CI 1.065–6.513，P=0.036）是OS的独立不良预后因素。

**总结与讨论**

研究结论：本研究表明，联合肿瘤穿透肽iRGD和抗PD-1抗体治疗在结直肠癌模型中提供了显著的治疗效果，该效应可能由基质NRP1（尤其是肿瘤血管系统中的NRP1）介导。基质NRP1表达具有很高的临床价值，因为它预示结直肠癌患者预后不良。这一发现支持其作为增强瘤内药物递送的治疗靶点的相关性，并为进一步研究基于iRGD的结直肠癌联合策略提供了依据。讨论部分指出，iRGD的肿瘤特异性活性与既往研究一致，且其对MSI-H和MSS模型的疗效提示iRGD可能通过突破物理和基质屏障使MSS结直肠癌对ICI产生响应。局限性包括皮下模型不能完全代表人类肿瘤特征，且NRP1缺失仅针对肿瘤细胞，未来需使用细胞类型特异性敲除模型和原位模型进一步验证。此外，人类标本中肿瘤细胞NRP1与预后无关联，可能与基质NRP1的显性作用有关。综上所述，基质NRP1是关键的预后标志物和治疗入口点。