谷胱甘肽与糖酵解通路的双重紊乱增强KRASG12C抑制剂的疗效

《Cancer Research Communications》：Disruption of GSH and glycolysis pathways enhances KRASG12C inhi... Open Access

　　

KRAS突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中普遍存在，但KRAS^G12C抑制剂疗效有限，部分原因是由于代谢适应性改变，如增强的谷胱甘肽代谢和糖酵解增加。谷胱甘肽S-转移酶ζ1（GSTZ1）是一种调节细胞代谢的代谢酶；然而其在KRAS驱动型肺癌中的作用尚未得到充分探索。研究人员近期报道，靶向GSTZ1可显著增强美国食品药品监督管理局（FDA）批准的KRAS^G12C抑制剂在非小细胞肺癌细胞中的疗效。非靶向代谢组学分析现揭示谷胱甘肽和糖酵解通路的显著改变，表现为GSTZ1敲除后乳酸水平降低和氧化型谷胱甘肽增加。此外，谷胱甘肽合成和葡萄糖摄取的药理学抑制模拟了靶向GSTZ1的增敏效应。这些代谢转变伴随AMPK磷酸化增强和AKT磷酸化降低，二者均为KRAS^G12C抑制反应的关键介导因子。研究数据揭示了与GSTZ1相关的代谢和信号改变促进药物耐药，并将GSTZ1鉴定为可使KRAS突变型非小细胞肺癌对KRAS靶向治疗敏感的潜在辅助靶点。研究意义：靶向GSTZ1通过扰乱糖酵解、谷胱甘肽代谢和蛋白质磷酸化使KRAS^G12C突变型非小细胞肺癌细胞对KRAS^G12C抑制剂敏感。GSTZ1作为药物耐药的介导因子和治疗靶点涌现，支持合理利用代谢脆弱性来增强KRAS靶向治疗疗效和改善预后的联合策略。

**研究背景与问题**

靶向治疗已使非小细胞肺癌（NSCLC）患者显著获益，包括携带KRAS^G12C突变的肿瘤患者。尽管KRAS^G12C靶向抑制剂如sotorasib和adagrasib已临床可用，但仅约30%至50%的患者显示出良好疗效反应，原因在于内在耐药机制的存在。药物治疗过程中常出现耐药性，限制了这些KRAS^G12C抑制剂的即时和长期疗效。临床前研究和临床观察已揭示多种耐药机制，包括异质性KRAS突变、可变KRAS表达以及持续的RAS信号依赖性。

除RAS家族蛋白的改变和信号重排外，代谢重编程是药物反应的关键贡献因素，特别是维持氧化还原稳态和支持治疗应激下糖酵解的代谢通路。癌细胞，包括KRAS突变型NSCLC，增加对抗氧化系统和谷胱甘肽（GSH）代谢的依赖以对抗肿瘤发生中升高的活性氧（ROS）。致癌性KRAS突变可促进糖酵解，从而增加葡萄糖摄取，为肿瘤生长关键的生物合成通路提供燃料。这种代谢转变使癌细胞通过维持能量生产和促进替代性存活机制来减轻KRAS抑制剂的作用。此外，代谢可塑性可使肿瘤即使在治疗过程中也产生耐药，并对实现KRAS靶向治疗的持久疗效反应构成重大挑战。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）蛋白家族在人体内作为重要的抗氧化酶和应激诱导信号调节因子发挥作用。过度活化的GST蛋白常在多种癌症中发现，参与细胞存活、增殖和药物耐药等关键致癌过程。许多GST酶专注于通过与GSH结合来解毒有害化合物；然而，GSTZ1主要作为马来酰乙酰乙酸异构酶发挥作用，利用GSH作为催化辅因子，催化酪氨酸和苯丙氨酸分解代谢终末步骤中马来酰乙酰乙酸向富马酰乙酰乙酸的异构化。这种特殊活性使GSTZ1直接参与氨基酸分解代谢并调节细胞氧化还原缓冲能力。机制上，GSTZ1活性的扰动可改变反应性中间体和GSH可利用度，对氧化应激信号和代谢通量产生下游影响。例如，GSTZ1近期被报道通过调节肝细胞癌中的NRF2/GPX4轴来调控氧化还原平衡和炎症，以及通过HMGB1/GPX4轴驱动膀胱癌细胞铁死亡。除其经典功能外，研究人员既往的化学蛋白质组学研究显示，GSTZ1构成NSCLC中的可成药性脆弱点，并参与细胞存活和药物反应信号，如FGFR1，特别是在KRAS^G12C突变背景下。这些致癌和氧化还原信号通路之间的生化和生物学联系，共同支持将GSTZ1作为KRAS突变肿瘤治疗反应调节因子进行研究。

AMP活化蛋白激酶（AMPK）是通过重编程细胞能量稳态以抑制肿瘤生长的癌症细胞代谢和应激反应的关键调节因子。AMPK活化抑制关键合成代谢过程，例如通过下调mTOR通路，同时诱导能量应激并触发代谢重编程和凋亡。这些效应为开发AMPK活化靶向抗癌治疗提供了坚实的框架。糖酵解抑制和氧化应激在肺癌细胞中AMPK活化中至关重要。糖酵解抑制可减少ATP产生并升高AMP/ATP比值，从而激活AMPK以启动分解代谢通路并抑制合成代谢过程以保存能量。氧化应激据报道可通过Thr172位点磷酸化增强AMPK活化，这在肺癌代谢适应中至关重要。因此，糖酵解抑制和氧化应激诱导的AMPK信号活化提供了开发靶向治疗的治疗杠杆点。已有临床前和临床研究强调AMPK活化剂增强常规化疗药物疗效、克服药物耐药和改善癌症治疗患者预后的潜力；例如，一项随机II期研究评估了AMPK活化剂二甲双胍（已批准用于2型糖尿病）联合紫杉醇/卡铂/贝伐珠单抗在NSCLC中的应用，支持将二甲双胍作为代谢佐剂以增强抗癌药物疗效的进一步研究。然而，目前尚无AMPK活化剂获批用于癌症治疗，单独或与KRAS抑制剂联合使用均有待进一步研究替代方法来靶向该通路。

**主要技术方法**

研究人员利用Moffitt肺癌卓越中心细胞系核心提供的多株KRAS^G12C突变型NSCLC细胞系（H1792、LU99、H358、H2122、HOP62、Calu-1、HCC1171）及非癌性肺细胞系（HBEC-30KT、Mouse-5），通过短串联重复序列分析进行细胞系鉴定。采用小分子干扰RNA（siRNA）介导的GSTZ1基因沉默和CRISPR-Cas9介导的基因敲除技术进行功能缺失研究，并通过表达质粒构建实现GSTZ1过表达。细胞活力测定采用CellTiter-Glo发光细胞活力检测法和台盼蓝排除法，克隆形成实验采用结晶紫染色。非靶向代谢组学分析采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS），在正负离子模式下进行数据采集，使用MZmine软件进行代谢物鉴定和定量，并通过迭代秩次归一化方法处理数据。免疫印迹分析用于检测蛋白表达和磷酸化水平，包括AKT、p44/42 MAPK（ERK1/2）、AMPKα、mTOR及其磷酸化形式。活性氧（ROS）水平通过2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFH-DA）荧光探针检测。细胞内GSH水平采用GSH检测试剂盒测定，乳酸水平采用L-乳酸检测试剂盒测定。生物信息学分析利用DepMap数据库分析代谢物丰度和基因表达水平与GSTZ1或KRAS基因依赖性的相关性，Enrichr进行通路和代谢物富集分析，Kaplan-Meier Plotter平台评估GSTZ1基因表达与肺癌患者总生存期、进展后生存期和首次进展的关联。

**研究结果**

**一、GSTZ1在KRAS^G12C突变型NSCLC中高表达并促进对KRAS^G12C抑制剂的耐药**

免疫印迹分析显示，与HBEC-30KT支气管上皮细胞和Mouse-5肺成纤维细胞两种非癌性肺细胞系相比，KRAS^G12C突变阳性NSCLC细胞系中GSTZ1蛋白水平升高。在H1792 NSCLC细胞中使用siRNA沉默GSTZ1不影响基础活力，但显著增强其对sotorasib或adagrasib的敏感性，而对Mouse-5成纤维细胞无影响。该增敏效应在KRAS^G12C抑制剂不敏感的LU99、Calu-1、H2122、HOP62以及敏感的HCC1171和H358细胞中得到验证。为检验GSTZ1靶向的增敏效应是否KRAS^G12C特异性，研究人员在携带KRAS Q61H突变的H460 NSCLC细胞和携带EGFR外显子19缺失突变的TC-9细胞中测试了GSTZ1敲低与泛RAS抑制剂RMC-7977的联合作用，观察到类似的增敏效应，表明GSTZ1靶向可产生更广泛的增敏作用，包括但不限于KRAS突变。相反，GSTZ1强制过表达减弱了H1792细胞对sotorasib的反应，证实GSTZ1在细胞对KRAS^G12C抑制剂反应中的调节作用。CRISPR介导的GSTZ1敲除在二维和三维细胞培养中均增强了KRAS抑制剂的抗增殖效应。此外，GSTZ1过表达不仅与肺癌细胞系中sotorasib活性显著相关，还与肺癌患者的总生存期、进展后生存期和首次进展显著相关。

**二、GSTZ1敲低通过扰乱氧化还原稳态和糖酵解重编程细胞代谢**

为研究GSTZ1靶向对细胞代谢的影响，研究人员在H1792细胞中对siGSTZ1、sotorasib或其联合处理96小时进行非靶向代谢组学分析。代谢组学结果显示，KRAS^G12C抑制和/或GSTZ1敲低导致糖酵解和GSH代谢的显著代谢改变。GSTZ1敲低后观察到乳酸显著降低、谷氨酰胺升高、氧化型GSH（GSSG）增加以及GSSG/GSH比值升高。GSH总量在GSTZ1敲低后与siNT处理相比无显著变化。值得注意的是，GSTZ1敲低后谷氨酰胺水平显著升高，这可能是对抑制抗氧化防御和糖酵解活性降低的代偿机制，因为谷氨酰胺作为能量来源和主要抗氧化剂GSH合成的前体发挥作用。代谢通路富集分析显示Warburg效应和GSH代谢显著富集，表明GSTZ1敲低后糖酵解通量受损和氧化失衡。此外，GSTZ1敲低改变了涉及嘌呤、嘧啶、糖酵解、氧化还原和脂肪酸通路的广泛代谢物。研究还检测到二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）水平升高，均为omega-3脂肪酸，表明GSTZ1在不饱和脂肪酸代谢中的额外作用。

为研究是否存在由GSTZ1靶向增敏的独特代谢表型，研究人员根据细胞对GSTZ1敲低联合KRAS抑制的敏感程度对细胞系进行分类，将H1792、H2122和H460归类为敏感，其余为较不敏感。利用DepMap基因表达数据鉴定两组之间的差异表达基因并进行通路和代谢物富集分析。敏感组显示GSH相关通路以及与GSH和丙酮酸代谢相关基因的显著富集。与此一致，谷氨酰胺丰度与GSTZ1和KRAS基因依赖性均呈正相关。这些发现与研究人员提出的机制模型一致，即GSTZ1敲低通过扰动GSH代谢和糖酵解通量使KRAS突变细胞敏感。

**三、GSTZ1维持GSH稳态并限制ROS积累**

在肝细胞癌中，GSTZ1靶向被报道通过非酶促旁路反应耗竭细胞内GSH池并通过增加ROS水平诱导氧化应激。因此，研究人员检测了多株KRAS^G12C突变细胞系中siGSTZ1处理48小时后的细胞内GSH水平。与GSH合成抑制剂BSO类似，GSTZ1敲低导致H1792、LU99和H358中GSH显著降低，而HOP62和H2122降低幅度较小。乳酸是癌细胞糖酵解的关键标志物，反映癌细胞依赖的Warburg效应以支持能量产生和细胞增殖。GSTZ1沉默后，研究人员发现H1792、HOP62和H358细胞内乳酸水平显著降低。由于检测到GSTZ1靶向后GSH水平降低，且GSH耗竭可导致ROS水平升高而引起氧化应激，研究人员使用H2DCFH-DA荧光检测ROS水平。正如预期，GSTZ1沉默后ROS水平显著增加，并可被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸减弱，这与肝癌中GSTZ1沉默后GSH降低和ROS升高的报道一致。重要的是，GSTZ1敲低联合sotorasib处理导致的细胞活力降低可被抗氧化剂trolox部分挽救。

**四、靶向GSH和糖酵解通路增强KRAS^G12C抑制剂疗效**

为确定糖酵解抑制和GSH耗竭是否与KRAS抑制剂敏感性有机制关联，研究人员将KRAS^G12C抑制剂分别与靶向GSH合成和糖酵解的小分子抑制剂联合使用。BSO联合处理显著增强sotorasib和adagrasib在H1792、H358、HOP62、LU99和H2122细胞中的细胞毒性。通过靶向葡萄糖转运蛋白在糖酵解上游发挥作用的Glutor也显著增强H1792、H358和HOP62细胞对KRAS^G12C抑制剂的敏感性。该增敏效应在LU99和H2122细胞中较不明显，提示通过糖酵解抑制的机制存在细胞类型特异性差异。

**五、GSTZ1靶向调控AMPK-AKT信号**

AMPK作为能量和氧化应激的传感器，在细胞处于氧化应激和糖酵解活性降低时通过Thr172位点磷酸化增加而被激活。更重要的是，AMPK负调控AKT和mTOR等关键下游信号效应分子，这些分子对KRAS突变癌细胞的存活和调节KRAS抑制剂敏感性至关重要。研究人员先前报道GSTZ1敲低影响蛋白质组范围的蛋白质酪氨酸磷酸化。现观察到GSTZ1敲低还显著降低ERK和AKT的磷酸化，这两个激酶是细胞存活和对KRAS^G12C抑制剂耐药的关键驱动因素。值得注意的是，AKT磷酸化的降低在H1792细胞中单独sotorasib处理时未观察到，提示GSTZ1独立于KRAS调控AKT信号。研究人员还发现AMPK磷酸化增加和mTOR磷酸化降低，表明肿瘤抑制因子AMPK的活化和促肿瘤mTOR的抑制。此外，BSO导致的GSH耗竭和Glutor导致的糖酵解抑制均增加AMPK磷酸化，重现了GSTZ1靶向对糖酵解和GSH代谢的效应。GSTZ1靶向后AMPK增加和AKT降低在LU99和HOP62细胞中也一致观察到。ERK磷酸化在sotorasib处理期间保持抑制。

**六、代谢应激感受器AMPK的药理学调节使KRAS^G12C突变型NSCLC细胞敏感**

为研究这些机制是否促进细胞对KRAS^G12C抑制剂的增敏作用，研究人员使用两种药理学AMPK活化剂。Acadesine（AICAR）是一种细胞透过性核苷，其细胞内转化的AICAR单磷酸代谢物结合调节性γ亚基以激活AMPK。二甲双胍是众所周知的AMPK活化剂，通过抑制线粒体呼吸链复合物I并在相对低剂量下促进AMPK αβγ复合物的形成发挥作用。结果显示，AICAR和二甲双胍均显著增强H1792细胞对sotorasib和adagrasib的反应。类似地，这些联合处理增加LU99细胞中sotorasib和adagrasib的细胞毒性，表明AMPK药理学活化模拟了GSTZ1敲低对细胞增敏的效应，从而突出AMPK在介导治疗反应中的作用。

**讨论与结论**

该研究通过揭示GSTZ1在代谢适应、药物疗效改善和细胞存活中的关键作用，为KRAS突变型NSCLC开辟了新治疗途径。研究发现GSTZ1表达赋予对KRAS^G12C抑制剂（包括sotorasib和adagrasib）的耐药性，而其缺失显著增强这些抑制剂在药物敏感和耐药NSCLC细胞中的活性。机制上，GSTZ1缺失诱导深层次的代谢重编程，特征是糖酵解通量和GSH代谢减弱，表现为乳酸和GSH水平降低以及GSSG和谷氨酰胺增加。这些转变产生能量和氧化应激状态，损害癌细胞活力并增强对靶向治疗的敏感性。该发现也与先前提出的氧化失衡和糖酵解受损与KRAS突变靶向疗效增加相关的研究一致。

重要的是，该研究进一步阐明了GSTZ1靶向的信号传导后果。研究人员先前发表的论文显示GSTZ1靶向对酪氨酸磷酸化蛋白质组的影响，现进一步观察到对多株KRAS^G12C突变阳性NSCLC细胞系中AKT和ERK活性的显著抑制效应，这是KRAS驱动肿瘤中存活和治疗耐药的关键驱动因素。同时观察到AMPK通路活化和mTOR磷酸化抑制，这些通路与氧化还原和能量应激以及随后的抗增殖反应密切相关。AMPK活化被认为具有抗肿瘤作用，并被报道增加KRAS^G12C突变NSCLC H23细胞的敏感性。KRAS^G12C突变被报道特异性提升肉碱和肉碱衍生物水平，这些参与脂肪酸氧化。一致地，代谢组学研究也显示sotorasib抑制KRAS^G12C后肉碱和相关衍生物降低。此外，先前研究显示GSTZ1缺失导致肝细胞癌中脂质过氧化增强和铁死亡诱导。该研究观察到两种omega-3脂肪酸EPA和DHA水平升高，二者已证明对肺癌细胞具有抗增殖作用。这一发现提示GSTZ1可能通过多种机制增强肺癌细胞对药物治疗的敏感性，包括调节氧化还原应激反应、糖酵解以及潜在地脂肪酸代谢。代谢和信号干扰的汇聚呈现GSTZ1作为影响上游代谢环路和下游存活通路的双重功能靶点。GSH合成或糖酵解抑制剂重现了代谢应激表型，如多株细胞系中AMPK磷酸化增加和KRAS^G12C抑制剂敏感性增强。LU99和H2122细胞对Glutor和KRAS^G12C抑制剂联合处理的增敏程度较低，表明对糖酵解和突变KRAS双重抑制的细胞类型特异性反应。这种差异可能与对KRAS^G12C抑制剂的差异性适应信号反应或代谢适应能力有关。例如，LU99细胞具有更强的通过高表达的丙氨酸氨基转移酶（GPT2）从丙氨酸生成糖酵解终产物丙酮酸的能力，这可能减轻Glutor对糖酵解的抑制效应。

从治疗开发角度，将糖酵解和/或氧化还原稳态与致癌KRAS突变共同靶向成为新兴且有吸引力的治疗方法，这一策略基于KRAS蛋白家族、癌细胞糖酵解和氧化还原平衡之间的密切相互作用。这些机制已在多种体外和体内癌症模型中得到广泛探索。目前已有涉及这些机制治疗KRAS突变癌症的临床试验正在进行。这些结果支持将代谢调节与靶向治疗联合以改善KRAS突变NSCLC初始药物反应的可行性。几种最近开发靶向KRAS突变的药物，如泛KRAS抑制剂BI-2865和RAS(ON)抑制剂daraxonrasib，可能选择与GSTZ1靶向联合，此类组合有待未来在药物不敏感的KRAS突变癌症模型中进行研究。

**研究结论**

GSH代谢和糖酵解在维持KRAS突变驱动的肿瘤发生中发挥重要作用，研究结果确立GSTZ1为调节GSH水平和糖酵解活性以配合KRAS功能的关键代谢和信号节点。这一发现将GSTZ1定位为KRAS突变NSCLC存活和治疗反应的新靶点。靶向GSTZ1不仅扰乱糖酵解和氧化还原稳态，还抑制AKT和mTOR等存活信号通路，同时刺激肿瘤抑制性AMPK信号。鉴于GST同工酶家族对细胞代谢和信号效应的类似调节作用，探究其他GST是否参与GSTZ1靶向和/或KRAS靶向抑制剂反应调节，以及多靶点GST和KRAS突变是否能引发更有效治疗结局，将具有重要研究价值。这些发现将为合理设计的联合策略奠定基础，利用代谢脆弱性增强KRAS靶向治疗的疗效。