抗PD-1抗体（aPD-1）和iRGD对肿瘤生长抑制作用的评估

《Cancer Research Communications》：Tumor growth inhibition by anti–PD-1 antibody (aPD-1) and iRGD was evaluate... Open Access

　　

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICI）在一部分结直肠癌患者中可产生持久反应，但获益主要局限于微卫星不稳定性高（microsatellite instability-high, MSI-H）肿瘤。研究人员研究了肿瘤穿透肽iRGD是否能增强抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1, PD-1）治疗的效果，并探讨了神经纤毛蛋白1（neuropilin 1, NRP1）表达的临床相关意义。研究人员使用同源小鼠模型（MSI-H MC38和微卫星稳定CT26）接受抗PD-1抗体和iRGD治疗。利用NRP1基因敲除的结直肠癌细胞系比较了肿瘤细胞和基质NRP1的贡献。研究人员对110例接受根治性手术的III期结直肠癌患者的连续队列进行免疫组化分析NRP1表达。iRGD和抗PD-1抗体联合治疗在两种结直肠癌模型中均增强了抗肿瘤效应，伴随瘤内CD8⁺ T细胞丰度增加及其功能改善。这种效应在缺乏肿瘤细胞NRP1的肿瘤中仍然存在，提示基质NRP1在介导iRGD活性中起关键作用。在结直肠癌患者的病理标本中，在肿瘤细胞、基质间隔和血管中均观察到广泛的NRP1表达，提示基于iRGD的疗法在人结直肠癌中具有潜在适用性。值得注意的是，基质NRP1表达与较差的总生存期和无病生存期相关。总之，这些发现将基质NRP1定位为基于iRGD的免疫检查点抑制剂策略的预后标志物和可操作的切入点，为其临床开发提供了强有力的依据，以将ICI的益处扩展到更广泛的结直肠癌人群。意义：研究人员证明了iRGD增强了结直肠癌模型中抗PD-1治疗的疗效，改善了瘤内通透性和抗肿瘤免疫反应。NRP1在肿瘤各隔室中广泛表达，而基质（尤其是内皮）NRP1是iRGD活性的关键介质，与不良预后相关，代表潜在的治疗切入点。

**论文解读：iRGD增强抗PD-1抗体治疗结直肠癌的效果及神经纤毛蛋白1的临床意义**

**研究背景与问题**

结直肠癌（colorectal cancer）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICI）在部分结直肠癌患者中能诱导持久反应，但临床获益主要局限于微卫星不稳定性高（microsatellite instability-high, MSI-H）的肿瘤，而占大多数的微卫星稳定（microsatellite-stable, MSS）肿瘤对ICI反应有限。导致这一局限的原因之一，是实体瘤（包括结直肠癌）内治疗药物的肿瘤特异性差和瘤内渗透不足。肿瘤穿透肽iRGD（internalizing RGD）通过与α_v整合素和神经纤毛蛋白1（neuropilin 1, NRP1）结合，可促进共给药药物的选择性积累和深部渗透，但其是否能增强ICI在结直肠癌中的疗效尚不清楚。此外，NRP1在肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）多个细胞区室（包括内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞）中均有表达，但其在结直肠癌中的表达谱和预后价值存在争议，尤其是不同细胞区室的贡献尚未明确。为此，研究人员设计了本研究，以探讨iRGD联合抗程序性细胞死亡蛋白1（anti–PD-1）抗体的治疗效果，并分析NRP1在肿瘤细胞和基质中的功能及临床相关性。该研究成果发表在《Cancer Research Communications》。

**主要关键技术方法**

研究人员使用了CRISPR-Cas9技术构建了NRP1基因敲除（NRP1-knockout, KO）的MC38小鼠结直肠癌细胞系，并通过Western blot验证。动物实验采用C57BL/6和BALB/c小鼠皮下接种MC38（MSI-H）或CT26（MSS）肿瘤模型，分别给予磷酸盐缓冲液（PBS）、iRGD、抗PD-1抗体或其联合治疗。使用Evans blue染料进行体内渗透性实验以评估iRGD介导的递送效果。免疫组化（IHC）、免疫荧光和流式细胞术用于分析肿瘤内CD8⁺ T细胞丰度、增殖标志物Ki-67和效应分子颗粒酶B（granzyme B）的表达。临床部分纳入110例来自京都大学医院（Kyoto University Hospital）接受根治性手术的III期结直肠癌患者的连续队列，采用IHC评估NRP1在肿瘤细胞、基质和血管内皮中的表达，并结合Kaplan–Meier生存分析和Cox比例风险模型进行预后分析。

**研究结果**

**iRGD增强共注射示踪剂以NRP1依赖性方式进入结直肠癌**

通过向皮下MC38或CT26荷瘤小鼠全身注射Evans blue染料并给予iRGD，发现iRGD处理组肿瘤内染料积累显著高于对照组，且不增加正常器官的摄取。该效应可被抗NRP1抗体阻断。在NRP1-KO MC38肿瘤中，与对照空载体（empty vector, EV）肿瘤相比，iRGD介导的染料摄取部分减弱，但仍有一定程度增加，提示基质来源的NRP1参与了这一过程。

**iRGD增强抗PD-1抗体在结直肠癌小鼠模型中的抗肿瘤效果**

在MSI-H MC38模型中，联合治疗组肿瘤体积和重量显著低于抗PD-1单药组和对照组，且iRGD单药无明显抗肿瘤活性，体重无显著差异。在MSS CT26模型中同样观察到联合治疗组的显著抑瘤效果，提示iRGD能增强抗PD-1抗体在MSI-H和MSS结直肠癌中的疗效。

**iRGD与抗PD-1联合治疗增加瘤内CD8⁺ T细胞丰度并改变其功能**

IHC分析显示，在两种模型中，联合治疗组瘤内CD8⁺ T细胞数量显著高于其他处理组。免疫荧光染色进一步表明，联合组中Ki-67⁺ CD8⁺ T细胞比例增加，提示增殖活性增强；颗粒酶B阳性细胞（主要位于肿瘤周边）也在联合组中增加。流式细胞术结果证实CD8⁺ T细胞占总CD45⁺免疫细胞的比例在联合组中显著升高，而调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）比例无显著变化。这表明确实iRGD联合抗PD-1抗体促进CD8⁺ T细胞的浸润、增殖和细胞毒功能。

**肿瘤细胞NRP1缺失不消除iRGD/抗PD-1联合治疗的效果**

发现MC38-NRP1-KO肿瘤生长显著慢于MC38-EV对照肿瘤，表明NRP1参与肿瘤进展。但令人意外的是，在NRP1-KO肿瘤中，iRGD联合抗PD-1治疗仍表现出抑制肿瘤体积和体重的趋势。免疫荧光染色显示NRP1-KO肿瘤中肿瘤细胞NRP1缺失，但CD31⁺血管内皮细胞和部分基质细胞中的NRP1表达保留，推测这些残留的基质NRP1介导了iRGD的残余效应。

**NRP1在人类结直肠癌中广泛表达**

对110例III期结直肠癌患者肿瘤组织进行的IHC分析显示，NRP1在肿瘤上皮细胞、基质区室和血管内皮细胞中均有不同程度表达。所有病例均检测到肿瘤细胞NRP1表达，且染色强度分布不均。超过90%的病例基质区室可检测到NRP1，约45%呈中至强染色。血管内皮细胞中的NRP1表达模式与基质区室类似。通过CD31和α-SMA的连续切片染色，验证了NRP1在血管相关区和非血管基质（即癌相关成纤维细胞rich区域）中均有表达，且血管区染色强度更高。

**基质NRP1表达与结直肠癌不良预后相关**

Kaplan–Meier生存分析显示，基质区室中高NRP1表达（而非肿瘤细胞中）与较短的总生存期（overall survival, OS；P=0.002）和无病生存期（disease-free survival, DFS；P=0.008）显著相关。血管内皮细胞中的高水平NRP1亦与较差的OS（P=0.012）相关。多因素Cox回归分析证实，高基质NRP1表达（风险比HR=2.783；95%置信区间CI 1.040–7.452；P=0.042）是独立不良预后因素，而肿瘤细胞NRP1表达无显著预后价值。临床病理特征分析显示，高基质NRP1表达与肿瘤高分化（P=0.013）和女性（P=0.002）相关。

**讨论与结论**

该研究表明，iRGD通过NRP1依赖性方式选择性增强结直肠癌肿瘤的药物递送，且基质NRP1（尤其在肿瘤血管中）在介导这一效应中发挥关键作用。联合治疗通过增加瘤内CD8⁺ T细胞的浸润、增殖和细胞毒活性而增强抗肿瘤免疫。在人类结直肠癌样本中，NRP1广泛表达于多个区室，且基质（尤其是血管内皮）NRP1的高表达与不良预后独立相关，提示其作为预后标志物和治疗靶点的潜力。研究指出，之前关于NRP1预后价值的不一致结果可能源于方法论差异和缺乏区室特异性评估。研究存在的局限性包括：皮下小鼠模型不能完全重现人类MSI-H和MSS结直肠癌的分子和免疫特征；NRP1基因敲除仅限于肿瘤细胞，未能直接评估基质NRP1的贡献，未来需借助细胞类型特异性KO模型进行验证。结论翻译：研究人员的研究表明，组合肿瘤穿透肽iRGD和抗PD-1抗体治疗在结直肠癌模型中提供了显著的治疗效果，可能由基质NRP1（特别是肿瘤血管中的NRP1）介导。基质NRP1表达具有高临床价值，因为它预测结直肠癌患者的不良预后。这一发现支持其作为增强瘤内药物递送的治疗靶点的相关性，并为进一步研究基于iRGD的结直肠癌联合治疗策略提供了依据。