利用神经纤毛蛋白1靶向肿瘤穿透肽增强结直肠癌免疫治疗反应

《Cancer Research Communications》：Enhancing Immunotherapeutic Response in Colorectal Cancer with a Neuropilin 1–Targeting Tumor-Penetrating Peptide Open Access

　　

免疫检查点抑制剂（ICI）可在部分结直肠癌患者中产生持久应答，但其获益主要局限于微卫星不稳定高水平（MSI-H）肿瘤。研究人员探究了肿瘤穿透肽iRGD是否能够增强抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）治疗的效果，并分析了神经纤毛蛋白1（NRP1）表达的临床相关性。研究人员使用抗PD-1抗体和iRGD处理同源小鼠模型（MSI-H MC38和微卫星稳定CT26）。通过NRP1敲除结直肠癌细胞系比较了肿瘤细胞与基质NRP1的贡献。对110例接受根治性手术的III期结直肠癌患者连续队列的肿瘤组织进行免疫组化分析NRP1表达。iRGD与抗PD-1抗体联合治疗在两种结直肠癌模型中均增强了抗肿瘤效应，伴随肿瘤内CD8⁺T细胞数量增加及其功能改善。肿瘤细胞NRP1缺失的肿瘤中该效应依然存在，提示基质NRP1在介导iRGD活性中发挥关键作用。在结直肠癌患者病理标本中，研究人员观察到NRP1在肿瘤细胞、基质和血管系统广泛表达，提示基于iRGD的疗法在人结直肠癌中具有潜在适用性。值得注意的是，基质NRP1表达与较差的总生存期和无病生存期相关。总体而言，这些发现将基质NRP1定位为预后标志物和基于iRGD的ICI策略的可利用切入点，为其临床开发以将ICI获益扩展至更广泛的结直肠癌人群提供了有力依据。意义：研究人员证明，iRGD在结直肠癌模型中增强了抗PD-1治疗疗效，改善了肿瘤内通透性和抗肿瘤免疫应答。NRP1在肿瘤各组分中广泛表达，其中基质（尤其是内皮）NRP1是iRGD活性的关键介质，与不良预后相关，代表了一个潜在的治疗切入点。

**论文解读文章**

**研究背景、问题与目的**

结直肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管细胞毒药物、分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICI）等系统治疗取得了显著进展，但不可切除或转移性患者的预后仍然较差。实体瘤治疗中的关键挑战之一是治疗药物的肿瘤特异性有限和瘤内穿透能力不足，这阻碍了系统治疗发挥最大潜力并导致治疗耐药。ICI（尤其是抗程序性细胞死亡蛋白1抗体anti–PD-1和抗程序性细胞死亡配体1抗体anti–PD-L1）在部分癌症类型中已取得突破性疗效，但在结直肠癌中，其临床获益主要局限于微卫星不稳定高水平（MSI-H）肿瘤，而该亚群仅占患者的一小部分。微卫星稳定（MSS）结直肠癌对ICI的总体应答有限，因此亟需能够增强治疗应答的联合策略。肿瘤穿透肽iRGD（internalizing RGD）通过与αv整合素和神经纤毛蛋白1（NRP1）结合，可促进共给药药物在肿瘤组织中的选择性积累和深层穿透，但其能否增强ICI在结直肠癌中的疗效尚不明确。此外，NRP1在结直肠癌中的表达谱和预后意义因方法学异质性和患者队列差异而存在争议。基于此，研究人员开展了本研究：探究iRGD联合anti–PD-1抗体是否能在结直肠癌同源小鼠模型中增强抗肿瘤疗效，明确NRP1在其中的功能贡献，并在人结直肠癌标本中评估NRP1的表达特征及其预后价值。该研究发表在《Cancer Research Communications》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用MC38（MSI-H）和CT26（MSS）同源小鼠皮下移植瘤模型进行体内治疗实验，通过尾静脉注射伊文思蓝（Evans blue）示踪剂评价iRGD介导的肿瘤渗透性。使用CRISPR-Cas9技术构建NRP1敲除（KO）的MC38细胞系以区分肿瘤细胞与基质NRP1的作用。利用免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术分析肿瘤内CD8⁺T细胞丰度、增殖（Ki-67）和活化标志（颗粒酶B）。人肿瘤组织标本来源于京都大学医院2014年4月至2018年3月期间接受根治性手术的110例III期结直肠癌患者连续队列，通过IHC法分析NRP1在肿瘤细胞、基质和血管内皮细胞中的表达，并与预后进行关联分析。

**研究结果**

1. **iRGD enhances NRP1-dependent entry of a coinjected tracer into colorectal cancers**：全身渗透性实验显示，iRGD共给药显著增强了伊文思蓝在MC38和CT26肿瘤中的积累，而在正常器官中无此效应。该作用依赖于NRP1，因抗NRP1抗体可阻断之。在MC38-NRP1-KO肿瘤中，iRGD仍使部分肿瘤的染料摄取增加，提示基质NRP1参与其中。

2. **iRGD potentiates the antitumor effect of anti–PD-1 antibody treatment in murine colorectal cancer models**：在MC38（MSI-H）和CT26（MSS）模型中，iRGD与anti–PD-1抗体联合治疗均显著抑制了肿瘤生长，肿瘤体积和重量较anti–PD-1单药治疗明显减小。iRGD单独使用未见抗肿瘤效应，且联合治疗未增加体重下降等脱靶毒性。

3. **Increased abundance of and functional alterations in intratumoral CD8⁺ T cells by iRGD and anti–PD-1 combination therapy**：免疫组化显示，在两种模型中联合组的肿瘤内CD8⁺T细胞数量显著高于其他治疗组；免疫荧光染色表明联合组中Ki-67⁺CD8⁺T细胞频率增加；颗粒酶B阳性细胞在联合组中亦增多。流式细胞术进一步证实，联合组CD45⁺免疫细胞中CD8⁺T细胞比例显著高于单药组，而调节性T细胞比例无显著差异。

4. **Deleting NRP1 expression in colorectal cancer cells does not abolish the effects of iRGD/anti–PD-1 combination therapy**：MC38-NRP1-KO肿瘤自身生长速度显著慢于对照肿瘤，提示NRP1参与结直肠癌进展。在NRP1-KO肿瘤中，iRGD/anti–PD-1联合治疗仍呈现肿瘤抑制趋势。免疫荧光显示NRP1-KO肿瘤中CD31⁺血管内皮细胞和部分基质细胞保留NRP1表达，可能介导了iRGD的残余效应。

5. **NRP1 is widely expressed in human colorectal cancer**：110例III期结直肠癌标本的IHC分析显示，NRP1在肿瘤细胞、基质和血管内皮细胞中均有不同程度的表达。超过90%的病例基质中可检测到NRP1，约45%呈现中至强染色。连续切片染色表明NRP1在血管相关区域和血管外基质（癌相关成纤维细胞丰富区域）均有表达，血管相关区域染色强度更高。

6. **Stromal expression of NRP1 correlates with poor prognosis in colorectal cancer**：Kaplan–Meier生存分析显示，基质NRP1高表达（而非肿瘤细胞NRP1高表达）与更短的总生存期（OS，P=0.002）和无病生存期（DFS，P=0.008）显著相关。血管内皮NRP1高表达也与较差的OS相关（P=0.012）。多变量Cox回归分析中，高基质NRP1表达（HR=2.783；95% CI 1.040–7.452；P=0.042）和未接受辅助化疗（HR=2.634；95% CI 1.065–6.513；P=0.036）是OS的独立不良预后因素。

**讨论与结论**

讨论部分总结：本研究证明iRGD以NRP1依赖性方式增强共注射药物在结直肠癌肿瘤内的递送；iRGD与anti–PD-1抗体联合治疗有效抑制了小鼠结直肠癌模型肿瘤生长，并伴随瘤内CD8⁺T细胞增殖和功能活化增加；肿瘤细胞NRP1缺失不足以消除iRGD的促渗透和联合治疗效果，提示基质（尤其是血管内皮）NRP1是关键介质。人结直肠癌标本中NRP1广泛表达，且基质NRP1高表达与不良预后独立相关，支持基质NRP1作为治疗靶点和预后标志物的价值。结论部分翻译如下：本研究表明，肿瘤穿透肽iRGD与抗PD-1抗体联合治疗在结直肠癌模型中产生了显著的治疗效果，该效应很可能由基质NRP1（尤其是肿瘤血管中的NRP1）介导。基质NRP1表达具有很高的临床价值，因为它能够预测结直肠癌患者的不良预后。这一发现支持NRP1作为增强肿瘤内药物递送的治疗靶点的相关性，并为在结直肠癌中进一步探索基于iRGD的联合策略提供了依据。