虾青素浓度在稀释液(extender)中对肉用公牛(beef bulls)精液冷冻后精子运动动力学(sperm kinetics)与脂质过氧化(lipid peroxidation)的影响

《Reproduction in Domestic Animals》：Impact of Astaxanthin Concentration in Extender on Sperm Kinetics and Lipid Peroxidation After Cryopreservation in Beef Bulls

　　

研究人员通过改变商品化蛋黄基稀释液(extender)中添加虾青素(ASTX)的浓度（0、1 μmol ASTX1、2 μmol ASTX2），评估其对肉用公牛(Bos indicus indicus，Nelore牛)精液冷冻后质量的影响。采集12头公牛各4次射精，共48份样本，分别在解冻后立即及46°C孵育30 min快速热抵抗试验(TRT)后检测。结果显示，ASTX组的快速精子百分比(RAP)和头部侧摆幅度(ALH)高于对照组（p＜0.05）；ASTX1组的总活力(TM)高于对照组（p＝0.004）。质膜完整性、顶体膜完整性及线粒体膜电位(MMP)在各处理间无显著差异；通过流式细胞术C11-BODIPY探针检测脂质过氧化(LP)，ASTX1组和对照组低于ASTX2组（p＝0.041）。TBARS法检测诱导氧化应激（精子）及自发氧化应激（精浆）在各组间无差异。研究人员得出结论：在稀释液(extender)中添加1 μmol ASTX可改善肉用公牛精液解冻后的精子运动动力学参数，尤以总活力(TM)、快速精子百分比(RAP)及头部侧摆幅度(ALH)为显著，且脂质过氧化水平未升高；2 μmol ASTX则未带来额外获益且在流式检测中脂质过氧化偏高。

研究人员以肉用公牛（Nelore，Bos indicus indicus）为研究对象，针对精液冷冻过程因温度变化与渗透压改变诱发过量活性氧（ROS）导致质膜损伤、精子活力下降的问题，探讨在商品化蛋黄基稀释液（extender）中添加不同浓度虾青素（ASTX）对冷冻后精子质量的影响。目前关于ASTX在肉用公牛精液冷冻中的应用研究较少，已有畜禽研究提示其抗氧化效应具有浓度依赖性，且稀释液基质（卵黄基与大豆卵磷脂基）及畜种差异可能影响最优添加量，因此有必要在肉用公牛中明确适宜浓度并系统评估精子运动动力学、膜完整性、线粒体功能与脂质过氧化等指标。该研究旨在为优化肉用公牛冷冻精液稀释液配方提供实验依据，论文发表于《Reproduction in Domestic Animals》。

关键技术方法：研究人员选用12头33.2±3.5月龄、体重741.5±33.75 kg的Nelore公牛（Bos indicus indicus），每头采集4次射精（间隔7天），共48份样本；将每份精液均分为3组，分别加入商品化蛋黄基稀释液（BotuBov，含7%甘油、卵黄等）作为对照（无ASTX）、ASTX1（添加1 μmol ASTX）、ASTX2（添加2 μmol ASTX），ASTX先用DMSO溶成储备液再按比例加入稀释液；冷冻采用程序降温（25℃至5℃ at ?0.25℃/min，平衡4 h；5℃至?80℃ at ?15℃/min；?80℃至?140℃ at ?20℃/min）后浸入液氮；解冻为37℃水浴30 s；检测时间点包括解冻后立即（thawed）与46℃孵育30 min快速热抵抗试验（TRT）；主要技术方法涵盖计算机辅助精子分析（CASA，IVOS系统）获取运动动力学参数，流式细胞术（BD LSR Fortessa）结合PI/FITC-PSA（质膜与顶体膜完整性）、YO-PRO/MitoStatus Red/MitoSOX Red（质膜 destabilisation、线粒体膜电位MMP、线粒体内超氧阴离子O₂^•?）、C11-BODIPY^581/591（脂质过氧化LP），以及TBARS法检测精子诱导氧化应激与精浆自发氧化应激（MDA当量），统计采用SAS 9.4的GLIMMIX重复测量模型。

结果

3 Results：研究人员通过方差分析与多重比较发现，处理与时间（解冻后 vs TRT后）无显著交互作用（p＞0.05）。在精子运动动力学方面，ASTX1与ASTX2组的快速精子百分比（RAP）和头部侧摆幅度（ALH）均显著高于对照组（p＝0.031及p＝0.001），ASTX1组的总活力（TM）高于对照组（p＝0.004），ASTX2组TM介于两者之间无显著差异；鞭打频率（BCF）在ASTX2组低于对照组（p＝0.007），直线性（LIN）与直进性（STR）在对照组高于ASTX组（p＝0.005及p＝0.003）。流式细胞术结果显示，质膜与顶体膜完整性（IPAM、SPM）、线粒体高膜电位百分比（HMP）、线粒体内超氧阴离子相关指标（CELLS_SO、HMP_SO、SO、STABLE_HMP、Quality HMP）及高线粒体超氧阴离子生成细胞百分比（MSA）在各处理间均无显著差异；脂质过氧化（LP，C11-BODIPY阳性细胞%）在ASTX1组显著低于ASTX2组（p＝0.042），对照组与ASTX1、ASTX2均差异不显著（对照组与ASTX2 p＞0.05）。TBARS检测精子诱导氧化应激（诱导TBARS）与精浆自发氧化应激（自发TBARS）在各组间均无显著差异（p＞0.05）。

讨论：研究人员指出冷冻过程诱发ROS过量导致脂质过氧化与精子动能下降，ASTX通过单线态氧能量转移机制（三重态ASTX以散热方式回到基态而不降解）发挥抗氧化作用，认为1 μmol ASTX保护了细胞能量相关结构从而改善TM、RAP、ALH，但并未提升质膜、顶体膜完整性及线粒体膜电位，这与RAM研究中ASTX提升质膜完整性的结果不同，可能与畜种、稀释液基质（蛋黄基 vs 大豆卵磷脂基）、ASTX浓度有关。研究人员分析流式法C11-BODIPY比TBARS更灵敏、能特异地在单细胞水平检测膜脂质过氧化，因此检出ASTX1与ASTX2的差异而TBARS未检出；ASTX2组脂质过氧化偏高的现象可能暗示高浓度ASTX存在浓度依赖性促氧化副作用，与Farzan等在乳用公牛中2 μmol ASTX未优于0.5、1 μmol的结果相呼应。对于LIN与STR在ASTX组降低、BCF在ASTX2降低，研究人员认为抗氧化剂的效应依赖于细胞氧化状态与浓度，ASTX因同时作用于膜亲水与疏水区可能微调膜流动性从而影响运动模式但不必然提升前向性。TRT后ASTX1仍保持高于对照的TM与RAP，且LIN、STR与对照无差异，说明1 μmol ASTX在热应激下维持了动能优势；但ASTX2在TRT后LIN、STR仍低于对照，提示高浓度无额外抗应激益处。研究人员也提到电刺激采精带来较多精浆，精浆内源性抗氧化系统可能掩盖部分组间差异，且DMSO溶剂虽文献支持低浓度安全但未设仅DMSO对照是局限。最后研究人员总结：ASTX添加到蛋黄基稀释液的效果具浓度依赖性，1 μmol ASTX为肉用公牛最适浓度，可提高解冻后总活力、快速精子百分比、头部侧摆幅度，且流式检测脂质过氧化未升高（低于2 μmol组），综合动能与氧化指标最为平衡；2 μmol ASTX则可能有潜在促氧化不利效应。研究支持1 μmol ASTX作为商品化稀释液添加剂优化肉用公牛冷冻精液质量。