《Yeast》：Genetic Tools in the Nakaseomyces clade for Evolutionary Comparisons of Signal Transduction Pathways
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中村酵母属（Nakaseomyces）提供了四个亲缘关系密切但特征迥异的物种。例如，N. glabratus（前称Candida glabrata）是常见的人类病原体， whereas N. bracarensis 和 N. nivariensis 虽在临床环
中村酵母属（Nakaseomyces）提供了四个亲缘关系密切但特征迥异的物种。例如，N. glabratus（前称Candida glabrata）是常见的人类病原体， whereas N. bracarensis 和 N. nivariensis 虽在临床环境中被分离到，但并非常见的人类病原体。N. delphensis 从水果中分离，尚无证据表明其具有致病性。鉴于这些差异，研究人员将该分支开发为分子遗传系统，可以在此系统中引入质粒并评估克隆启动子的转录输出。研究人员工程化了一种CRISPR/Cas9质粒，该质粒允许对gRNA进行快速Gibson克隆，为氨基酸和核苷酸生成了营养缺陷型菌株，并向每个物种引入了质粒。研究人员使用启动子-YFP质粒确定，虽然物种之间存在差异，但每个物种可能都具有完整的硫胺素和磷酸盐（THI和PHO）信号转导通路，且N. glabratus和N. bracarensis中的基因表达彼此更为相似，而非与另外两个物种相似。最后，研究人员确定N. glabratus、N. bracarensis和N. nivariensis可在小鼠巨噬细胞中持续存在24小时，而N. delphensis则不能。该工作描述了中村酵母属遗传操作的新分子工具，并允许探索进化问题。
本研究旨在开发中村酵母属（Nakaseomyces）的分子遗传工具，以探索该分支四个物种的进化差异，特别是关于全基因组复制（WGD）和基因丢失如何影响生态位特化的问题。病原真菌已成为医院感染的主要原因，而N. glabratus（光滑念珠菌）的发病率已接近著名的病原体白念珠菌（Candida albicans）。该分支包含三个哺乳动物病原体和一个非病原物种N. delphensis，且三个病原物种具有不同的基因扩增，提示致病性可能多次独立起源。此外，中村酵母属与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同属后全基因组复制类群，但其解决WGD的方式在不同生态位中存在差异。该物种为单倍体、在标准培养基中生长、Crabtree阳性，部分物种已被遗传改造，因此具备作为比较进化遗传学模式的潜力。研究人员开展此项研究旨在构建遗传可操作的体系，以探究进化问题，如新近进化的启动子在没有见过这些启动子的物种中是否功能正常。
研究人员在本研究中运用了以下主要技术方法：基于 CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9）的基因编辑技术，通过工程化改造的CRISPR/Cas9质粒（含PacI克隆位点）快速克隆gRNA（向导RNA）以制备营养缺陷型菌株；利用 Gibson 克隆技术进行质粒构建；采用 S. cerevisiae 来源的ARS/CEN（自主复制序列/着丝粒）质粒系统进行基因转化；通过流式细胞术定量分析启动子-YFP（黄色荧光蛋白）融合蛋白的荧光表达；以及基于J774.A1小鼠巨噬细胞系的细胞持续性实验评估物种致病潜力。
研究结果部分围绕三个主题展开：
**3.1 四种中村酵母属物种生长特性的表征**
通过基因组BLAST（基本局部比对搜索工具）分析确认，四种中村酵母属物种均不含有合成硫胺素（B1）、烟酸（B3）、吡哆醇（B6）和生物素（B7）所需的基因。实验证实，所有物种在30°C和37°C下均能在含12种氨基酸、腺嘌呤和尿嘧啶的合成培养基中生长，但在缺乏硫胺素、烟酸或吡哆醇的培出息中无法生长。值得注意的是，仅N. glabratus具有能够清除硫胺素的外源磷酸酶，这是由于其PMU1-3位点存在串联重复扩增。此外，S. cerevisiae在吡哆醇饥饿条件下表现出生长延迟，这与ScSNO/SNZ基因的诱导延迟有关。
**3.2 利用CRISPR/Cas9制备中村酵母属营养缺陷型菌株**
研究人员通过Gibson克隆将gRNA序列整合到工程化的CRISPR/Cas9质粒中，该质粒含有靶向NgADE2的gRNA作为平行红白转化效率筛选标记。通过醋酸锂转化法将质粒引入各物种，以诺尔丝菌素（nourseothricin）抗性或尿嘧啶原养型进行筛选。研究发现尿嘧啶筛选存在渗漏现象，故主要采用诺尔丝菌素抗性筛选。研究人员成功制备了N. glabratus的leu2突变体以及其他物种的his3突变体，并通过PCR和测序确认了框移突变。此外，还构建了N. glabratus的ade2his3ura3和leu2his3ura3三重突变体。各gRNA的成功率差异较大，范围从0%到100%不等。
**3.3 为S. cerevisiae设计的ARS/CEN质粒可有效转化中村酵母属**
使用S. cerevisiae来源的ARS/CEN质粒进行醋酸锂转化时，针对尿嘧啶、组氨酸或亮氨酸原养型的选择可获得20-500个转化子。但N. bracarensis、N. delphensis和N. nivariensis的转化效率较N. glabratus或S. cerevisiae低5-10倍。为验证异源基因表达能力，研究人员引入了含ScTHI5或ScSNZ1/SNO1的质粒。结果显示，ScTHI5过表达可在所有物种中赋予不同程度的硫胺素原养型，ScSNZ1过表达可赋予吡哆醇原养型（N. nivariensis生长极慢）。然而，N. nivariensis即使在强启动子控制下表达ScSNZ1或ScTHI5时仍生长不良，提示可能存在质粒稳定性差或启动子表达效率低的问题。
**3.4 中村酵母属中启动子-YFP质粒的表达表明转录已针对物种进行优化**
为区分质粒稳定性与启动子优化表达的贡献，研究人员构建了含1 kbp启动子-YFP转录融合的质粒。各族ADH1启动子在各自匹配物种中表达水平相近，表明质粒在各物种中稳定性相当且启动子能够实现高水平表达。S. cerevisiae中ScADH1启动子表达较低，这与ARS/CEN质粒的严格拷贝数控制（通常1-2拷贝/细胞）有关，且仅S. cerevisiae表现出双峰YFP表达。跨物种启动子分析显示，所有启动子均能功能表达，但不同物种间存在变异，且中村酵母属启动子在S. cerevisiae中普遍表达较低。
针对硫胺素调控启动子的研究揭示：ScTHI4和NgTHI4启动子在N. glabratus和N. bracarensis中高表达，但在N. nivariensis和N. delphensis中表达极低（均值荧光100-3000 a.u.）。然而，NnTHI4和NdTHI4启动子在各自原生种及N. glabratus、N. bracarensis中均能被硫胺素饥饿上调，NbTHI4也在N. glabratus中高度表达。这些结果表明所有物种均具有功能性的THI通路，启动子已针对各物种优化，且N. glabratus整体表达效率更高。
关于新近进化启动子的跨物种功能：仅N. glabratus具有外源磷酸盐调节的酸性磷酸酶编码基因NgPMU2和外源硫胺素调节的硫胺素焦磷酸酶编码基因NgPMU3。NgPMU2和NgPMU3启动子在N. bracarensis中的调控模式与N. glabratus相似，提示N. bracarensis仍保留识别这些启动子的反式调控因子；N. nivariensis完全无法上调这些启动子，而N. delphensis仅能轻微上调。这表明随着物种间进化距离增加，反式作用因子识别顺式元件的能力逐渐丢失。
**3.5 N. glabratus、N. bracarensis和N. nivariensis能够持续存在于巨噬细胞存活模型中，而N. delphensis不能**
利用已表征的小鼠巨噬细胞持续性实验，研究人员评估了各物种的致病潜力。结果显示，除N. delphensis外，其他物种均表现出与N. glabratus相似的巨噬细胞持续性。使用野生型N. delphensis和N. nivariensis重复实验得到相同结果，排除了营养缺陷型标记影响的可能性。N. delphensis被清除的原因尚不明确，可能与其在37°C下生长较慢有关，这与临床分离情况一致。
**讨论部分总结：**
研究人员开发的遗传工具实现了四个中村酵母属物种间的基因穿梭。通过引入稳定质粒，确认了ScTHI5表达足以赋予四种物种硫胺素原养型，ScSNZ1表达足以赋予吡哆醇原养型（尽管N. nivariensis含这些基因的质粒生长较差）。THI4在各物种中硫胺素饥饿时均被上调，表明尽管失去了硫胺素合成能力，这些物种仍能感知硫胺素浓度并调节基因表达。
CRISPR/Cas9技术的应用使研究人员能够制备营养缺陷型菌株，并确定切割位点以产生框移突变，这建立在他人的转化和CRISPR/Cas9操作工作基础之上。虽然未在本手稿中展示，但研究人员曾成功在N. nivariensis中通过500 bp同源臂删除LEU2并替换为诺尔丝菌素抗性盒，但效率极低（约80个菌落中仅1个正确删除）。这与非glabratus物种转化效率较低、同源重组效率不如N. glabratus的观察一致。研究人员认为优化转化条件并将修复模板与CRISPR/Cas9靶点结合可能提高特异性菌株的构建效率。
研究揭示了一些有趣的对比：中村酵母属ADH1启动子在S. cerevisiae中表达较差，可能部分由于质粒拷贝数维护问题。各族ADH1启动子在各自物种的质粒上表达水平相近，支持质粒拷贝数在种内并非主要影响因素，但这一推测有待质粒拷贝数的直接量化验证。
最后，遗传模型的建立使研究人员能够探究NgPMU2和NgPMU3启动子的调控特性。这些启动子在S. cerevisiae中基本无功能，表明转录因子与新近进化启动子之间存在不兼容性。而中村酵母属物种间的比较显示，NgPMU2和NgPMU3在N. glabratus和N. bracarensis中行为相似，提示两物种均具有响应磷酸盐和硫胺素饥饿的反式和顺式作用元件；相反，N. nivariensis和N. delphensis仅能最小程度上调这些启动子，表明反式作用因子无法有效识别启动子中的顺式元件。这些结果并不意味着N. nivariensis和N. delphensis的THI和PHO通路失活，而只是这些新启动子在这两个物种中无法被调控。本研究提供了概念验证，但反式因子和顺式元件的更详细解析有待后续研究。
**研究结论翻译：**
研究人员已利用CRISPR/Cas9在四种中村酵母属物种中生成更多分子遗传工具。该工作表明N. glabratus和N. bracarensis在其 Acer 虫虫很多相似性，而N. delphensis和N. nivariensis则表现得更为趋异。构建这些模型系统为研究人员操作这四个具有不同生态位的物种提供了更多工具。
