来自Bacillus velezensis SY01的胞外蛋白相关抗真菌成分的发酵优化与特性研究：其对Cytospora pyri的抑制作用

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Fermentation Optimization and Characterization of Extracellular Protein-Associated Antifungal Components from Bacillus velezensis SY01 against Cytospora pyri

　　

沙帅帅|徐凌凯|傅灿鹏|韩秋燕|丁家琪|冯北北|张燕|萨比努尔·努尔梅梅特|谢盼

中国喀什大学高级农业科学学院及南疆作物生物技术育种与智能栽培研究中心，喀什844000

摘要

本研究探讨了Bacillus velezensis SY01产生的与细胞外蛋白相关的抗真菌成分对苹果溃疡病原体Cytospora pyri的抑制作用。通过发酵优化、理化特性分析、分子量分级、SDS-PAGE以及基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析，评估了这些活性成分的性质。在培养基中添加5.00 g/L葡萄糖后，SY01无细胞发酵上清液的抗真菌活性显著增强，抑制率从54.6%提高到75.3%。该抗真菌活性对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，在60°C以上的高温处理后活性显著下降，并受pH值强烈影响，在pH 7.0时活性最高。多级透析结果显示，主要活性成分存在于>10 kDa的组分中；SDS-PAGE分析显示，在优化后的发酵组中，几种蛋白质条带主要分布在18至55 kDa之间。比较LC-MS/MS分析表明，葡萄糖的添加增加了细胞外组分中检测到的蛋白质的丰度和多样性，其中包括多种与蛋白酶/肽酶相关的蛋白质及应激相关蛋白质。由于这些候选蛋白质是通过相关蛋白质组学分析鉴定出来的，因此其直接的抗真菌作用仍需进一步的功能验证。总体而言，本研究提供了初步证据，证明与细胞外蛋白相关的成分参与了B. velezensis SY01对C. pyri的抗真菌作用，为开发基于蛋白质的苹果溃疡生物防治策略提供了基础。

引言

Bacillus属（Bacillus spp.）包含许多广泛应用于农业病害防治的生物防治细菌。其中，Bacillus velezensis因其强大的环境适应性、快速定殖能力以及合成多种抗菌代谢产物的能力而受到越来越多的关注1, 2, 3。这些代谢产物包括环状脂肽（如表面活性素、风霉素和杆菌霉素D），以及多种蛋白质类抗菌物质（如抗菌蛋白、抗菌肽和细胞壁降解酶）4, 5。与低分子量的次级代谢产物相比，蛋白质类抗菌物质通常具有更高的靶标特异性、更好的生物降解性，并能直接作用于病原体的细胞壁、膜或关键代谢过程。因此，基于蛋白质的抗真菌物质是B. velezensis生物防治潜力中一个重要但尚未充分探索的组成部分[3]。

近年来，已对不同B. velezensis菌株产生的多种蛋白质类抗菌物质进行了研究，其生物学功能也日益明确。例如，来自B. velezensis BvZ45-1的细胞外草酸脱羧酶Odx_S12可以降解Verticillium dahliae的毒力因子草酸，从而抑制真菌生长并降低病原体感染性[5]。从B. velezensis CB6中纯化的抗菌蛋白CB6-E对耐药Escherichia coli B2表现出强烈的抑制作用[6]。此外，B. velezensis HN-Q-8产生的细菌素Lcn972具有优异的热稳定性、pH耐受性和病原体诱导表达特性[7]。这些研究表明，B. velezensis产生的蛋白质类物质通过多种机制发挥作用，可能为生物防治提供宝贵资源。

然而，仍存在一些知识空白。以往关于B. velezensis产生的蛋白质类或与蛋白质相关的抗菌物质的研究主要集中在一年生作物、土传病害或细菌性病原体上5, 7，而它们在抑制木本植物溃疡病害中的作用尚不明确。东亚地区的苹果溃疡病与Valsa/Cytospora属病原体有关，最近在苹果和梨溃疡病病原体的命名学分类中也提到了C. pyri。尽管B. velezensis具有广泛的生物防治潜力，并已被报道能抑制苹果Valsa溃疡病，但其对C. pyri具有抗真菌作用的细胞外蛋白质成分仍缺乏详细研究。特别是，这些成分的分子量分布、理化稳定性及候选细胞外组分中的蛋白质仍不清楚，这限制了针对苹果溃疡病的基于蛋白质的生物防治策略的开发。

新疆具有独特的生态环境，环境压力大且病原体群落独特。从当地苹果组织中分离出的微生物菌株可能具有更强的生态适应性和生物防治潜力。在先前的研究中，使用传统组织分离方法从健康苹果树皮组织中分离出了B. velezensis SY01，其在体外对C. pyri表现出显著的抗真菌活性。然而，目前尚不清楚这种活性是否由细胞外蛋白质类物质介导，哪些分子量组分起主要作用，以及哪些蛋白质参与了病原体的抑制过程。我们假设B. velezensis SY01对C. pyri的抗真菌活性部分是由具有特定分子量特性的细胞外蛋白质化合物和可识别的功能蛋白介导的。因此，本研究旨在优化SY01的发酵条件，评估其抗真菌物质的蛋白质性质和理化稳定性，确定活性组分的分子量分布，并通过LC-MS/MS蛋白质组学分析鉴定候选抗真菌蛋白。本研究的新颖之处在于系统地分析了来自新疆的B. velezensis菌株针对苹果溃疡病原体C. pyri的细胞外蛋白质类抗真菌成分。这些发现为将SY01作为苹果溃疡病生物防治资源提供了理论和技术基础。

章节片段

测试菌株

苹果溃疡病原体C. pyri CXTA 329和生物防治菌B. velezensis SY01均来自喀什大学植物病理学实验室的菌株库。C. pyri CXTA 329最初是从中国新疆塔里木盆地采集的有症状苹果溃疡组织中分离得到的，并通过形态特征和分子系统发育分析得到鉴定[9]。选择该菌株用于本研究是因为它表现出

发酵条件优化

使用琼脂孔扩散法评估了葡萄糖、Fe²⁺和Mg²⁺添加对B. velezensis SY01发酵上清液抗真菌活性的影响。CK组为在不含葡萄糖或金属离子的LB基础培养基中培养的SY01。如图1a所示，Fe²⁺处理下的抗真菌率从0.56%增加到2.79 mg/L，在2.79 mg/L时达到最大值59.4%。进一步增加Fe²⁺浓度至3.91 mg/L后，抗真菌率有所下降

讨论

Bacillus属细菌的生物防治机制包括环状脂肽的产生、水解酶的分泌、营养和生态位竞争、生物膜的形成以及诱导宿主抗性2, 18。环状脂肽（如表面活性素、伊图林、风霉素和杆菌霉素D）被广泛认为是基于Bacillus的生物防治系统中的主要抗真菌代谢产物25, 26。然而，本研究的多项独立观察表明，细胞外蛋白质类物质也发挥了重要作用

结论

本研究表明，B. velezensis SY01对C. pyri CXTA 329的抗真菌活性与细胞外蛋白质类物质密切相关。主要抗真菌活性成分存在于>10 kDa的组分中，活性组分中的蛋白质条带主要分布在18至55 kDa之间。该抗真菌活性对蛋白酶处理、高温和极端pH值敏感，表明蛋白质类成分起到了重要作用

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

数据可用性声明

本研究中的原始贡献包含在文章/补充材料中。如有进一步疑问，请联系相应作者。

徐凌凯：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，监督，研究，资金获取，概念构思。沙帅帅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，监督，研究，数据管理，概念构思。谢盼：方法学设计，数据分析，数据管理，概念构思。萨比努尔·努尔梅梅特：研究，资金获取。张燕：监督，研究。冯北北：监督，方法学设计。丁家琪：监督，

数据可用性声明

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资助

本研究得到了新疆维吾尔自治区科学技术部（项目编号2025D01B14）、人力资源和社会保障部（项目编号GCC2025ZK-039）、新疆维吾尔自治区教育部（项目编号XJEDU2025P080）、喀什大学校级项目（项目编号[2024]2884）以及喀什大学院级研究项目（项目编号GCC2023ZK-007）的支持

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢喀什大学植物病理学实验室提供的实验设施和技术支持。同时感谢参与菌株保存、发酵实验和抗真菌活性测定的学生和同事们的协助。