一个类似YjiC的UDP-糖基转移酶CtYjiC调控平头炭疽菌（Colletotrichum truncatum）的黑色素化、感染相关发育和致病力

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：A YjiC-like UDP-glycosyltransferase CtYjiC regulates melanization, infection-related development and virulence in Colletotrichum truncatum

　　

由平头炭疽菌（Colletotrichum truncatum）主要引起的大豆（Glycine max）炭疽病是制约全球大豆生产的重要因素，但研究人员对其致病性的分子机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员建立了一个高效的农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）系统，用于C. truncatum菌株TB8-06，并生成了一个包含2139个转化子的T-DNA插入文库。通过优化转化参数，实现了稳定的T-DNA整合，其中单拷贝插入的比例较高，从而构建了适用于正向遗传筛选的高质量转化子群体。对1000个突变体的致病性测定鉴定出16个致病力显著降低的突变体。对一个致病力缺陷型突变体（T860）的分子特征分析揭示，T-DNA插入在一个编码假定UDP-糖基转移酶的基因中，该基因被命名为CtYjiC。靶向敲除CtYjiC导致黑色素化显著降低、产孢能力受损、分生孢子萌发减少、附着胞形成缺陷，以及在大豆叶片和豆荚上的致病力减弱，而与野生型和互补菌株（CtYjiC-C）相比，营养生长基本不受影响。值得注意的是，CtYjiC敲除导致在大豆豆荚上近乎完全丧失致病性。综上所述，研究人员的结果表明，CtYjiC在协调C. truncatum的感染相关发育和致病性中起着关键作用。本研究为这一病原菌的功能基因组学建立了一个高效的遗传平台，并强调了糖基化介导的代谢调控是真菌致病性的重要因素。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
大豆（*Glycine max*）是全球重要的作物，但其生产常受到真菌病害的威胁。其中，由平头炭疽菌（*Colletotrichum truncatum*）引起的大豆炭疽病是造成产量和品质损失的主要限制因素，该病原菌能侵染大豆从幼苗到成熟的所有发育阶段。尽管在其他炭疽菌属（*Colletotrichum*）物种中已有很多关于致病性分子机制的研究，但对大豆致病性 *C. truncatum* 的毒力决定因子的功能鉴定仍十分有限。长期以来，真菌黑色素（melanin）被证实与附着胞（appressorium）的膨压产生和宿主穿透密切相关，然而，在 *Colletotrichum* 物种中，调控黑色素合成和感染相关形态发生的上游代谢调控机制尚不完全清楚。此外，UDP-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase, UGT）家族成员在细菌和植物中广泛参与次级代谢和应激响应，但在真菌致病性中的作用，尤其是在 *Colletotrichum* 物种中，几乎未被探索。因此，研究人员旨在建立高效的遗传操作平台，通过正向遗传学手段鉴定 *C. truncatum* 中调控致病性的新基因。

**研究内容与结论**
研究人员优化并建立了适用于大豆源 *C. truncatum* 分离株TB8-06的农杆菌介导转化（*Agrobacterium tumefaciens*-mediated transformation, ATMT）系统，构建了包含2139个转化子的T-DNA插入突变体库。通过筛选1000个突变体的致病性，获得16个致病力显著减弱的突变体，并鉴定出一个关键基因 *CtYjiC*，其编码一个类似YjiC的UDP-糖基转移酶。通过同源重组敲除和互补实验证实，CtYjiC是调控黑色素合成、分生孢子产生、孢子萌发、附着胞形成以及在大豆叶片和豆荚上完全致病力的多效性调控因子，但不影响营养生长。研究表明，糖基化介导的代谢调控是真菌致病性的重要因素。该论文发表在《*Physiological and Molecular Plant Pathology*》。

**关键技术与方法**
研究人员主要采用以下技术方法：（1）优化ATMT系统参数（孢子浓度、农杆菌密度、共培养时间和温度），构建T-DNA插入突变体库（转化子总数2139个）；（2）对1000个转化子进行离体大豆叶片致病性筛选，通过ImageJ软件定量病斑面积；（3）利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增T-DNA侧翼序列，通过与NCBI中 *C. truncatum* 基因组数据库（Accession: PRJNA670759）比对确定插入位点；（4）采用融合PCR构建基因替换载体，通过聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化进行 *CtYjiC* 的靶向敲除，并利用酵母同源重组构建互补菌株；（5）通过黑色素提取和分光光度法测定相对含量，在洋葱表皮和疏水玻片上观察孢子萌发和附着胞形成。

**研究结果**

**3.1 ATMT条件的优化**
通过系统优化孢子浓度（10⁶孢子/mL）、农杆菌密度（OD₆₆₀=0.6）、共培养时间（48 h）和温度（22–24°C），研究人员实现了最高转化效率（每10⁶孢子获得600–800个转化子），为后续突变体库构建提供了基础。

**3.2 T-DNA插入转化子群体的生成与分子特征**
利用优化后的ATMT方法，研究人员获得2139个潮霉素抗性转化子。对20个随机转化子的PCR检测证实均含有 *hph* 基因；Southern blot分析显示80%（16/20）的转化子为单拷贝T-DNA插入；荧光显微镜观察证实GFP在菌丝、分生孢子、萌发孢子、附着胞、初级侵染菌丝和分生孢子盘等各生活史阶段稳定表达。连续五代无选择培养后，所有转化子仍保持潮霉素抗性，表明T-DNA插入稳定遗传。

**3.3 致病性缺陷突变体的筛选**
对编号1–1000的转化子进行离体大豆叶片致病性筛选，与野生型TB8-06相比，16个突变体（占筛选总数的1.6%）表现出显著减弱的致病力，其中6个突变体致病力极显著降低（p<0.001），被选作进一步分子鉴定。

**3.4 T-DNA侧翼序列的鉴定**
通过TAIL-PCR成功扩增出6个极低致病力突变体（T27, T55, T435, T744, T787, T860）的T-DNA侧翼序列，BLAST比对确定了插入位点及对应的候选基因。其中，突变体T860的插入位点位于一个编码假定UDP-糖基转移酶的基因（XM_036727938.1）内，该蛋白与 *Bacillus licheniformis* 的YjiC高度同源，故命名为CtYjiC。

**3.5 *CtYjiC* 敲除突变体与互补菌株的构建**
通过同源重组将 *CtYjiC* 编码区替换为 *hph* 盒，获得两个独立敲除突变体（ΔCtYjiC1和ΔCtYjiC4）；PCR和交接PCR验证了正确重组。互补菌株CtYjiC1-C通过将全长 *CtYjiC* 基因（含自身启动子和终止子）导入ΔCtYjiC1中构建，经PCR和博来霉素抗性验证确认。

**3.6 CtYjiC调控黑色素生物合成与产孢**
表型分析显示，与野生型和互补菌株相比，ΔCtYjiC突变体的营养生长速率（菌落径向生长和菌丝鲜重）无显著差异，但菌落黑色素含量显著降低，菌落几乎呈白色。黑色素提取定量实验证实敲除突变体黑色素水平极显著下降，互补菌株部分恢复。此外，敲除突变体的产孢量也显著低于野生型，互补菌株部分恢复。

**3.7 CtYjiC是感染相关发育和致病力所必需的**
在洋葱表皮上，ΔCtYjiC突变体的分生孢子萌发率和附着胞形成率均显著低于野生型，互补菌株恢复至接近野生型水平。离体大豆叶片致病性测定显示，野生型产生大面积扩展病斑并形成大量黑色分生孢子盘，而敲除突变体病斑显著缩小且无可见分生孢子盘；互补菌株部分恢复致病力。台盼蓝染色进一步揭示，ΔCtYjiC突变体在叶片内菌丝扩展受限，无法形成典型分生孢子盘。在大豆豆荚上，野生型产生明显病斑，而敲除突变体几乎不产生可见病斑，互补菌株部分恢复。原始T-DNA插入突变体T860也表现出类似的黑色素减少和致病力减弱表型。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次为大豆源 *C. truncatum* 优化了ATMT系统，其共培养时间（48 h）不同于辣椒源分离株（72 h），提示不同寄主来源菌株可能存在T-DNA递送的菌株特异性需求。CtYjiC是 *C. truncatum* 中首个被鉴定的YjiC家族糖基转移酶致病性调控因子。ΔCtYjiC突变体的多效性表型（黑色素减少、产孢缺陷、萌发和附着胞形成下降）表明该糖基转移酶在感染相关发育阶段特异性发挥作用，而不影响营养生长，与稻瘟病菌（*Magnaporthe oryzae*）中II型糖基转移酶MoGT2的功能相似。黑色素对于附着胞的成熟和功能穿透至关重要，CtYjiC可能通过修饰黑色素前体或间接调控色素合成途径来实现调控。此外，YjiC类糖基转移酶的广谱底物特异性提示CtYjiC可能还作用于黄酮类等次级代谢物，影响氧化应激响应，进而调控致病性过程，尽管这些机制仍需实验验证。

**研究结论**：在 *C. truncatum* 中，CtYjiC作为一种多效性糖基转移酶，协调黑色素化、产孢、分生孢子萌发、附着胞形成和致病力。研究人员的工作建立了适用于大豆致病性 *C. truncatum* 的优化ATMT平台，并揭示了糖基化介导的代谢调控是真菌致病性的关键决定因素。