《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Multifactorial suppression of Erwinia amylovora by the apple flower endophyte Pantoea agglomerans AFF2001
梨火疫病（由梨火疫病菌(Erwinia amylovora)引起)对全球苹果和梨的生产构成重大威胁。铜制剂的环境负面影响以及抗生素抗性的出现促使研究人员开发更环保的管理策略。现已证实，苹果花中存在能够限制E. amylovora定殖花组织的细菌类群。由于苹果花是E. amylovora的主要侵染位点，其内生微生物群是潜在的生物防治剂(BCAs)的储存库。本研究中，研究人员从意大利特伦蒂诺地区采集的健康苹果花(栽培品种金帅(Malus domestica cv. Golden Delicious))中分离内生细菌，并筛选其对E. amylovora的抑制能力。基于16S rRNA基因测序，细菌分离物主要属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和微杆菌科(Microbacteriaceae)。在测试的菌株中，成团泛菌(Pantoea agglomerans)AFF2001在新生苹果花和未成熟梨切片上抑制E. amylovora的效果最佳。研究人员结合体外和植物体内试验来探究P. agglomerans AFF2001与E. amylovora之间的相互作用。该菌株表现出显著的接触依赖性生长抑制作用。它能显著酸化模拟柱头培养基，从而降低E. amylovora细胞的存活率和运动性。此外，在与E. amylovora共存时，P. agglomerans AFF2001的嗜铁素(siderophore)产生增加，表明存在活跃的铁元素竞争。对P. agglomerans AFF2001基因组的分析鉴定了负责产生嗜铁素和有毒次级代谢产物的生物合成基因簇，以及可能参与接触依赖性拮抗的VI型分泌系统(Type VI secretion system, T6SS)编码基因。利用pUT-miniTn5-Km进行的随机转座子突变揭示，参与调控途径、运动性和氨基酸生物合成的基因对P. agglomerans AFF2001的生物防治活性具有贡献。这些结果表明，P. agglomerans AFF2001对E. amylovora的抑制涉及多种相互作用的机制，包括营养和铁竞争、环境酸化、干扰植物病原菌运动性以及接触依赖性相互作用。研究结果强调苹果花内生菌是宝贵的生物防治剂储存库，并鉴定P. agglomerans AFF2001为可持续梨火疫病管理策略的有前景的候选菌株。
该论文发表于《Physiological and Molecular Plant Pathology》期刊，旨在深入研究梨火疫病的生态学以寻找替代传统抗生素和铜基化合物的可持续防控策略。
研究背景方面，梨火疫病由革兰氏阴性菌梨火疫病菌(
Erwinia amylovora)引起，该病原菌被列为欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)的A2类检疫性有害生物。苹果(
Malus domestica)和梨(
Pyrus communis)是其主要寄主，梨火疫病对全球多地苹果和梨产业造成严重威胁。目前，抗生素和铜基化合物是控制该病最有效的手段，但其使用因环境污染和
E. amylovora抗生素抗性、铜耐受种群的出现而引发严重担忧。微生物生物防治剂(BCAs)作为减少植物病原菌致病性和毒力的微生物，是替代传统化学处理的有前景的选择。已有多种从苹果叶际分离的微生物被用于抗
E. amylovora测试，并成为商业生物农药的活性成分，如Bloomtime、BlightBan C9-1和Blossom Protect。然而，多年田间试验表明，这些产品并非在所有环境条件下都能持续提供完全的抑病效果。因此，鉴定新的、更高效的BCAs仍是优先任务。在梨火疫病循环中，花朵是主要侵染位点。
E. amylovora细胞最初在柱头表面附生生长，随后通过花托(hypanthium)进入植物维管系统。宿主相关菌群可显著影响病害发展。宏基因组分析显示，不同苹果品种具有高度保守的花部细菌群落，主要由假单胞菌科和肠杆菌科成员组成。研究表明，从苹果柱头分离的
Pantoea和
Pseudomonas菌株联合应用可显著降低花朵火疫病发生率。尽管苹果花内生菌控制
E. amylovora的潜力已得到充分证实，但其拮抗活性的机制尚不清楚。
研究人员从意大利特伦蒂诺地区采集的健康苹果花(栽培品种金帅(
Malus domestica cv. Golden Delicious))中分离内生细菌，筛选其拮抗
E. amylovora的活性，并采用分步筛选策略，先在植物活体测定中评估对
E. amylovora的控制效果。研究选出了在离体苹果花和梨切片上抑制病害效果最佳的菌株作为BCA候选菌，并通过一系列体外试验探究其拮抗机制。为更贴近花部组织的营养和环境条件，研究人员开发了基于苹果柱头分泌物化学成分的部分柱头基础培养基(PSBM)。研究还对最有效BCA候选菌
P. agglomerans AFF2001进行了基因组测序，以鉴定可能参与拮抗
E. amylovora的遗传特征，随后进行非靶向突变以产生敲除突变体，并在体外和体内对其进行表征。
研究得出以下主要结论：从苹果花中分离的大多数内生细菌属于肠杆菌科、假单胞菌科和微杆菌科；
P. agglomerans AFF2001在离体苹果花和未成熟梨切片上表现出最高的抑病效果；该菌株通过接触依赖性抑制、环境酸化、铁竞争、干扰病原菌运动性等多种机制发挥生物防治作用；基因组分析揭示了与嗜铁素、有毒次级代谢产物生物合成相关的基因簇以及T6SS编码基因；随机转座子突变表明，调控途径、运动性和氨基酸生物合成相关基因对该菌株的生物防治活性具有贡献。该研究的重要意义在于，首次将苹果花内生菌作为生物防治剂的来源进行了系统研究，鉴定了
P. agglomerans AFF2001这一有前景的候选菌株，并揭示了其多因子抑制的分子机制，为开发可持续的梨火疫病管理策略提供了理论基础。
研究用到的主要关键技术方法包括：16S rRNA基因测序用于细菌鉴定和系统发育分析；Biolog表型微阵列(Phenotype MicroArray?)用于比较代谢谱；离体苹果花和未成熟梨切片上的植物保护效性评估；烟草叶片过敏性反应(HR)抑制试验；接触依赖性和非依赖性抗菌活性测定；铬天青S(CAS)琼脂法测定嗜铁素产量；部分柱头基础培养基(PSBM)中的生长曲线分析；细菌培养滤液对
E. amylovora生长、运动性和生物被膜形成的影响评估；Oxford Nanopore技术进行全基因组测序和组装；基于mini-Tn5系统的随机转座子突变及反式PCR进行分子表征。
研究结果部分如下：
**苹果花内生细菌主要属于肠杆菌科、微杆菌科和假单胞菌科，且代谢谱与
E. amylovora部分重叠。** 通过16S rRNA基因测序从健康苹果花中鉴定出13株内生细菌，系统发育分析显示多数属于肠杆菌科、微杆菌科和假单胞菌科。其中革兰氏阴性菌占主导，仅3株为革兰氏阳性菌。Biolog表型微阵列分析表明，肠杆菌科成员（包括
E. billingiae AFF4005、
P. agglomerans AFF2001、
R. aquatilis AFF4004、
Y. rochesterensis AFF5003和
Y. similis AFF3001）的碳源利用谱与
E. amylovora Ea21相似，尤其对葡萄糖及其衍生物表现出强烈偏好。
P. agglomerans AFF2001与Ea21在碳源利用上的重叠度最高，包括N-乙酰-D-葡萄糖胺、果糖、琥珀酸、D-半乳糖、D-海藻糖和果胶等。氮源利用方面，Ea21优先同化天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和色氨酸，这些底物也被多种肠杆菌科和假单胞菌科菌株利用。
**乙酸钙不动杆菌(
Acinetobacter sp.)AFF2002、萎蔫短小杆菌(
Curtobacterium flaccumfaciens)AFF2009、
P. agglomerans AFF2001和极端假单胞菌(
Pseudomonas extremaustralis)AFC1001在苹果花和梨切片上有效抑制
E. amylovora。** 在离体苹果花上的筛选中，预防性施用上述4株菌显著降低火疫病症状严重度，防效分别为44.44±5.73%、51.11±5.54%、62.22±5.02%和26.66±3.39%。在未成熟梨切片上，
Acinetobacter sp. AFF2002、
C. flaccumfaciens AFF2009和
P. agglomerans AFF2001的防效分别为86.77±3.40%、76.86±6.13%和100%，其中
P. agglomerans AFF2001实现完全保护。
P. extremaustralis AFC1001则引起梨组织广泛褐变，无法可靠评估其对
E. amylovora毒力的影响。
**
P. agglomerans AFF2001降低烟草叶片过敏性反应发展和
E. amylovora种群数量。** 在烟草HR测定中，
P. extremaustralis AFC1001未能抑制HR发展，而
Acinetobacter sp. AFF2002、
C. flaccumfaciens AFF2009和
P. agglomerans AFF2001分别使HR降低69.50±6.29%、56.41±9.29%和90.61±3.55%。仅
P. agglomerans AFF2001显著降低病原菌丰度，使Ea21RfR数量降低约3个数量级。
**
P. agglomerans AFF2001对
E. amylovora表现出强烈的接触依赖性抗菌活性。** 在接触依赖性试验中，
P. agglomerans AFF2001完全抑制Ea21RfR生长，且该效果不受菌株浓度（10
7或10
8 CFU mL
-1）影响。而
Acinetobacter sp. AFF2002和
C. flaccumfaciens AFF2009仅表现部分抑制。在非接触依赖性试验中，所有菌株均未产生可检测的扩散性抗菌物质。
**
P. agglomerans AFF2001在
E. amylovora存在时嗜铁素产量增加。** CAS试验中，
Acinetobacter sp. AFF2002和
C. flaccumfaciens AFF2009未检测到嗜铁素产生。相反，
P. agglomerans AFF2001产生明显的CAS变色晕圈，且与Ea21共接种时显著增加26.54±4.95%，表明
E. amylovora的存在刺激了
P. agglomerans AFF2001的嗜铁素产生。
**细菌培养滤液影响
E. amylovora生长和运动性。**
P. agglomerans AFF2001在PSBMT中培养后使培养基pH从7.00±0.01降至3.51±0.03。其原始pH(TQ)培养滤液使Ea21细胞存活率降低42.48±1.45%，pH调整至7后抑制效果减弱至22.97±1.45%，表明酸化是重要抑病机制，但pH中性条件下仍有显著抑制效应，提示存在其他拮抗因子。运动性试验中，
P. agglomerans AFF2001的TQ培养滤液完全抑制Ea21的游动(swimming)和涌动(swarming)运动，pH调整后仍分别降低约52.36±2.73%和27.69±3.70%。各菌株培养滤液对Ea21生物被膜形成无显著影响。
**
P. agglomerans AFF2001的基因组组装和基因组特征。** 该菌株草图基因组(JBUXNA000000000)由5,054,504 bp组装为5个重叠群(contig)，G+C含量54.8%。最大重叠群(3,994,567 bp)被鉴定为染色体。antiSMASH分析鉴定到与芳基多烯(aryl polyene)和嗜铁素frederiksenibactin生物合成相关的基因簇，Contig_5上含有脱铁胺(desferrioxamine) E和类胡萝卜素生物合成基因簇，Contig_4上存在与参考簇相似性66%的推定灰藤黄酸(griseoluteic acid)生物合成基因簇。染色体上还鉴定到编码T6SS的基因，包括结构蛋白、调控元件和辅助因子，形成完整的T6SS装置，以及两个推定的T6SS效应基因。
**
P. agglomerans AFF2001突变体在苹果花和梨切片上生物防治活性降低。** 通过随机转座子突变筛选，获得3株突变体AFF2001-AP2、AFF2001-AP13和AFF2001-AP24。生长动力学表明各突变体最终细胞密度与野生型相当。在离体苹果花上，除AFF2001-AP2外，其余突变体显著降低保护效果，AFF2001-AP24效果最弱(22.40±10.46%)。在未成熟梨切片上，仅AFF2001-AP24处理出现Ea21渗出物和可见褐变，保护效果降至63.28±8.81%，Ea21细胞数与未处理对照相当。
**
P. agglomerans AFF2001突变体的转座子插入位点和表型表征。** 分子鉴定显示，AFF2001-AP2的rcsA基因（编码胶状多糖合成调控蛋白）被插入；AFF2001-AP13的pdeR基因（编码c-di-GMP磷酸二酯酶）被插入；AFF2001-AP24的leuA基因（编码2-异丙基苹果酸合酶）被插入。表型分析显示，AFF2001-AP2生物被膜形成减少；AFF2001-AP13游动运动性降低、涌动行为增强、生物被膜形成增加、嗜铁素产量减少；AFF2001-AP24完全丧失游动和涌动运动性、无生物被膜形成、无嗜铁素产生。所有突变体培养滤液均能酸化PSBMT，但AFF2001-AP24酸化程度显著低于野生型。各突变体培养滤液仍能抑制Ea21生长，但AFF2001-AP24效果较弱。
讨论部分，研究人员指出苹果花微生物群落可作为对抗
E. amylovora定殖的自然屏障。本研究从健康苹果花中分离的内生细菌主要属于肠杆菌科、假单胞菌科和微杆菌科，与既往报道一致，表明苹果花部微生物群落结构相对保守。代谢谱分析显示，
P. agglomerans AFF2001与
E. amylovora在碳源和氮源利用上高度重叠，提示营养竞争可能是其限制
E. amylovora在花部定殖的机制之一，且
E. amylovora所需氨基酸在苹果柱头分泌物中含量极低，可能加剧微生物间的竞争。
研究采用先从植物活体测定筛选的策略，避免了仅依据体外拮抗活性选择候选菌的偏差。筛选出的4株有效菌株中，
P. extremaustralis AFC1001因引起非典型火疫病症状的褐变反应且不能抑制HR而不适合作为商业产品开发。
P. agglomerans AFF2001则表现最为一致和优异，在梨切片上实现完全抑病，并显著降低烟草叶片中
E. amylovora种群。
在模拟花部营养条件的PSBMT中进行体外试验，
P. agglomerans AFF2001表现最强接触依赖性抗菌活性，完全抑制
E. amylovora生长，类似于商业菌株
P. agglomerans E325和
P. vagans C9-1的行为。基因组挖掘发现的D-丙氨酰灰藤黄酸生物合成基因簇和完整T6SS与接触依赖性拮抗一致，但这些潜在机制尚需靶向诱变实验验证。
铁竞争也是重要机制。
P. agglomerans AFF2001的嗜铁素产生因
E. amylovora存在而增加，且基因组中含有脱铁胺E生物合成基因，该嗜铁素已知参与
E. amylovora致病性。环境酸化是另一关键发现，
P. agglomerans AFF2001将PSBMT pH降至抑制
E. amylovora生长和运动性的水平，这对病原菌从柱头向蜜腺迁移至关重要。即使pH调整后培养滤液仍有抑制效应，表明存在额外代谢物或信号分子。
突变体表型进一步支持生物防治的多因子性质。rcsA突变影响生物被膜形成；pdeR突变导致运动性和嗜铁素产量改变；leuA突变产生营养缺陷型，表现多效性表型，包括酸化能力降低、生物被膜和嗜铁素丧失，植物保护效果严重下降。这些结果是首次直接将rcsA、pdeR和leuA与
P. agglomerans对
E. amylovora的生物防治性能联系起来。
研究人员同时指出，
P. agglomerans被列为欧盟生物安全2级生物，部分菌株与植物或机会性人类感染相关，因此在田间应用前需进行完整的生物安全性评估。该菌株可作为单一BCA，也可与
Acinetobacter sp. AFF2002和
C. flaccumfaciens AFF2009等兼容菌株组成合成微生物群落(SynCom)，通过功能互补和微生物协同增强病害抑制。对于
C. flaccumfaciens AFF2009，需排除其潜在植物病原性。
研究结论：该研究旨在推进对梨火疫病生态学的理解，以识别替代传统抗生素和铜基化合物的可持续防控策略。尽管已有多种BCAs开发用于管理
E. amylovora，但其效果仍不足以在所有田间条件下持续抑制病害。因此，需要进一步探索苹果花微生物群以鉴定新的、互补的BCAs。在从健康苹果花分离的内生菌株中，
P. agglomerans AFF2001成为最有效的
E. amylovora Ea21拮抗菌。该内生菌显著降低离体苹果花火疫病症状发展，并在未成熟梨切片上完全抑制病害症状。此外，
P. agglomerans AFF2001削弱了
E. amylovora Ea21的毒性和致病性，如梨组织上渗出物产生减少和烟草叶片中过敏性反应减弱所示。
P. agglomerans AFF2001的生物防治活性由多种机制贡献，包括营养和铁竞争、环境酸化、抑制病原菌运动性和接触依赖性拮抗。这些相互作用的多因子性质表明，没有单一机制单独负责病害抑制；而是它们的联合效应限制了病原菌在花部的定殖和增殖。基因组分析通过揭示可能参与种间相互作用的生物合成基因簇和分泌系统进一步支持了这一结论。总之，该研究结果凸显
P. agglomerans AFF2001是抗火疫病生物防治策略开发的有前景候选菌株。在生物安全性和植物病原性评估确认其适用性后，该菌株可进一步开发为独立的生物防治剂或设计为合成微生物群落的组分，通过微生物互补性和协同作用增强病害抑制。
