《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Characterization of highly virulent Phakopsora pachyrhizi isolates reveals novel Rpp gene-specific virulence trade-offs and strategic gene-pyramiding opportunities
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由豆薯层锈菌（Phakopsora pachyrhizi）引起的亚洲大豆锈病（ASR）是孟加拉国最具破坏性的大豆叶部病害之一，每年造成显著产量损失。由于病原菌毒力快速进化，ASR的有效管理仍面临重大挑战。近期研究记录了孟加拉国出现高度多样化和高毒力的P. pa
由豆薯层锈菌（Phakopsora pachyrhizi）引起的亚洲大豆锈病（ASR）是孟加拉国最具破坏性的大豆叶部病害之一，每年造成显著产量损失。由于病原菌毒力快速进化，ASR的有效管理仍面临重大挑战。近期研究记录了孟加拉国出现高度多样化和高毒力的P. pachyrhizi群体，强调了制定先进策略以有效管理这些群体的必要性。本研究旨在通过利用携带关键Rpp基因的近等基因系（NILs），从两个高毒力的孟加拉国P. pachyrhizi群体（BdRPs）中选择性纯化并鉴定高毒力单孢子分离株。获得了两个高毒力单孢子分离株BdRP-56.V7.S10和BdRP-58.V7.S13，它们在大多数Rpp背景上相较于原始群体表现出增强或相当的毒力，但在Rpp2上毒力显著降低，表明存在潜在的毒力权衡。顺序纯化和互交NIL分析表明，针对Rpp1-b或Rpp5的毒力选择会损害对Rpp2的毒力，反之亦然。这种模式支持一种潜在的新型权衡，即对某个Rpp基因的毒力增强与对另一个Rpp基因的毒力降低相关联。对包含二、三、四和五Rpp基因金字塔化的大豆品系进行评估发现，含有Rpp2的基因组合（特别是Mo42-1（Rpp1+Rpp2+Rpp4）、Oy49-4（Rpp2+Rpp3+Rpp4）、Py8-1-15-6（Rpp2+Rpp3+Rpp5）、No6-12-1（Rpp2+Rpp4+Rpp5）、Py7-1-8-5（Rpp1-b+Rpp2+Rpp5）、Py1-1-45（Rpp1+Rpp2+Rpp3+Rpp4）、Py2-3-39（Rpp1+Rpp2+Rpp4+Rpp5）和Py9-1-2-7（Rpp1+Rpp2+Rpp3+Rpp4+Rpp5））对两个分离株赋予强至近乎完全的抵抗。杀菌剂试验表明，嘧菌酯（喹诺酮外部抑制剂，QoI）、丙硫菌唑（脱甲基化抑制剂，DMI）和叶菌唑（DMI）即使在低浓度（4 ppm）下也对测试分离株提供优异的防控效果，预防值高达100%。另一方面，氟吡菌酰胺（琥珀酸脱氢酶抑制剂，SDHI）在较低浓度（20 ppm和4 ppm）下效果减弱。两个菌株的SdhC、SdhB和SdhD亚基的推导氨基酸序列与敏感菌株相同，提示除已知DNA突变外的其他机制可能导致观察到的杀菌剂活性降低。这些发现强调了策略性部署Rpp基因和审慎选择杀菌剂对于管理孟加拉国高毒力ASR群体的重要性，并为理解P. pachyrhizi的毒力互作引入了新的概念框架。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
大豆是全球重要的经济作物，但由豆薯层锈菌（*Phakopsora pachyrhizi*）引起的亚洲大豆锈病（ASR）是导致产量损失的主要叶部病害，在孟加拉国尤为严峻。该国大豆平均产量仅为全球平均水平的67%，病害贡献了约23%的产量损失。P. pachyrhizi具有极高的遗传和致病型变异性，持续产生新的生理小种，能快速克服寄主抗性。目前ASR管理主要依赖杀菌剂，但病原菌已出现抗药性。同时，利用抗性基因（Rpp）进行寄主抗性育种是优选策略，但单一Rpp基因常因病原菌毒力快速进化而失效。孟加拉国近期发现高毒力和高多样性的P. pachyrhizi群体，许多Rpp基因已效力下降。因此，亟需解析高毒力分离株的特性，并评估Rpp基因金字塔化（Gene pyramiding）和杀菌剂的应用策略。
**研究目的与开展**
本研究旨在从孟加拉国两个高毒力P. pachyrhizi群体（BdRP-56和BdRP-58）中选择性纯化出高毒力单孢子分离株，验证其毒力谱，探索Rpp基因间的毒力权衡关系，评估不同Rpp基因组合金字塔化品系的抗性效果，并检测主要杀菌剂类型对高毒力分离株的预防效果及靶基因突变，以期为制定可持续的ASR综合管理策略提供依据。
**主要技术方法**
研究人员利用携带Rpp1至Rpp6及Rpp1-b的7个近等基因系（NILs）对两个田间群体进行逐步筛选并纯化单孢子，获得两个高毒力单孢子分离株BdRP-56.V7.S10和BdRP-58.V7.S13。通过接种Rpp-NILs验证毒力谱，采用顺序纯化毒力漂移试验和互交NIL毒力再评估试验解析毒力权衡。利用24种含二、三、四和五Rpp基因组合的金字塔化大豆品系（部分来自此前研究，部分由Yamanaka等2022年开发）进行抗性评估。采用四种杀菌剂（丙硫菌唑、叶菌唑、氟吡菌酰胺、嘧菌酯）在三个浓度进行预防性药效试验，并通过对靶标基因SdhB、SdhC、SdhD进行Sanger测序和焦磷酸测序分析突变。
**研究结果**
**3.1 高毒力单孢子P. pachyrhizi分离株的筛选、分离与选择**
通过逐步接种7个Rpp-NILs，两个群体均能产生孢子，证实其对所有七个Rpp基因具有毒力。单孢子纯化后获得BdRP-56.V7.S10和BdRP-58.V7.S13两个分离株，它们在感病品种BRS184上表现出稳定且较高的产孢能力，被选为代表性菌株。
**3.2 单孢子分离株在Rpp-NIL大豆品系上的毒力验证**
与原始群体相比，两个单孢子分离株在Rpp1、Rpp1-b、Rpp3、Rpp5上毒力显著增强或相当，在Rpp4和Rpp6上无显著差异，但在Rpp2上毒力显著降低（产孢量、每病斑夏孢子堆数、有夏孢子堆病斑率均下降），提示存在毒力权衡。
**3.3 逐步纯化过程中对Rpp2毒力的顺序变化**
在BdRP-56逐步纯化过程中，早期阶段（Rpp1、Rpp3、Rpp4、Rpp6、Rpp2背景）的分离株对Rpp2仍保持高毒力；但经Rpp5筛选后的分离株（BdRP-56.R134625）开始出现毒力下降，经Rpp1-b筛选后的BdRP-56.V7及最终单孢子分离株BdRP-56.V7.S10在Rpp2上毒力明显降低，表明Rpp5和Rpp1-b的筛选压力累积性削弱了Rpp2毒力。
**3.4 BdRP-56分离株的互交NIL毒力验证**
将原始群体及分别从Rpp1-b、Rpp2、Rpp5 NIL上回收的分离株进行互交接种。结果发现：Rpp1-b来源分离株对Rpp2毒力降低，但对Rpp5不变；Rpp2来源分离株对Rpp1-b和Rpp5毒力均下降；Rpp5来源分离株对Rpp2毒力降低，但对Rpp1-b不变。这揭示了Rpp基因特异性毒力权衡：Rpp1-b毒力→Rpp2毒力降低，Rpp2毒力→Rpp1-b和Rpp5毒力降低，Rpp5毒力→Rpp2毒力降低。
**3.5 Rpp金字塔化品系对高毒力分离株的抗性效力**
24种Rpp金字塔化品系中，多数含Rpp2的二基因组合（如Mo84-6 Rpp1+Rpp2、No12-1-A Rpp2+Rpp5等）表现出强抗性；不含Rpp2的二基因组合（如Mo83-7 Rpp1+Rpp4等）则易感。三基因组合中，包含Rpp2的品系（Mo42-1、Oy49-4、Py8-1-15-6、No6-12-1、Py7-1-8-5等）表现出完全或近完全抗性（夏孢子堆数和产孢量为0），而不含Rpp2的Py6-1-17（Rpp3+Rpp4+Rpp5）对不同分离株反应不同。四基因和五基因组合（Py1-1-45、Py2-3-39、Py9-1-2-7）对两个分离株均表现完全免疫（NoU=0, SL=0, %LU=0%），Py3-1-31（Rpp2+Rpp3+Rpp4+Rpp5）也近乎完全。表明Rpp2在抗性中发挥关键作用，但多基因金字塔化可进一步增强抗性广度。
**3.6 高毒力分离株的杀菌剂抗性与靶基因序列突变**
嘧菌酯（QoI）、丙硫菌唑（DMI）和叶菌唑（DMI）在所有测试浓度（100、20、4 ppm）下均对两个分离株提供99.11%~100%的预防效力，EC50均<4 ppm。氟吡菌酰胺（SDHI）在100 ppm下完全有效，但在20 ppm和4 ppm下预防值分别降至94.67%~95.47%和1.89%~11.11%，EC50为10.20和11.90 ppm。Sanger测序和焦磷酸测序未检测到两菌株的SdhB、SdhC、SdhD亚基与敏感日本菌株E1-4-12存在任何导致氨基酸替换的DNA突变（包括已知的I86F突变），提示氟吡菌酰胺敏感性降低可能由其他机制引起。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究发现的高毒力单孢子分离株在Rpp2上毒力降低，且在Rpp1-b、Rpp2、Rpp5之间存在Rpp基因特异性毒力权衡，这为抗病育种提供了新视角——病原菌适应某一Rpp基因可能产生对其他特定Rpp基因的适应性代价，从而支持利用基因组合进行持久抗性。对146份来自其他国家的样本调查表明，同时具备Rpp2与Rpp1-b或Rpp2与Rpp5毒力的样本频率较低，提示该权衡可能具有普遍性。Rpp金字塔化品系评估显示，包含Rpp2的品系尤其有效，但无Rpp2的多基因组合在一定条件下仍可提供部分抗性。杀菌剂测试表明孟加拉国ASR群体对QoI和DMI类高度敏感，但对SDHI类氟吡菌酰胺敏感性下降且机制不明。研究人员强调应策略性部署多Rpp基因组合并审慎使用杀菌剂。
**研究结论**
孟加拉国P. pachyrhizi分离株BdRP-56.V7.S10和BdRP-58.V7.S13对大多数Rpp基因（除Rpp2外）表现出与原始群体相当或更强的毒力，表明逐步毒力筛选有效纯化了高毒力菌株，同时也提示原始群体（BdRP-56和BdRP-58）中Rpp2毒力表达与其他Rpp基因之间存在潜在拮抗关系。顺序筛选和互交NIL分析进一步表明，对Rpp1-b或Rpp5的适应伴随着对Rpp2毒力的下降，反之亦然，揭示了这些基因间的拮抗互作。多Rpp基因金字塔化的大豆品系对这些高毒力菌株表现出强抗性，某些基因组合近乎完全免疫。杀菌剂测试显示三种主要类型杀菌剂的有效性。总之，这些发现强调了策略性多Rpp基因部署和审慎使用杀菌剂对于孟加拉国高毒力ASR病原菌长期管理的重要性。需采用更广泛分离株进行额外研究以确认这些发现的普遍适用性。
