关于Coprinellus disseminatus ACR3在转基因烟草中赋予的砷抗性机制的见解：砷的排泄、叶绿体的保护以及细胞壁的增厚

《Plant Science》：Insights into the arsenic resistance mechanisms conferred by Coprinellus disseminatus ACR3 in transgenic tobacco: Arsenic excretion, chloroplast protection, and cell wall thickening

　　

陈江红|秦丽军

教育部重点实验室——山区植物资源保护与种质创新实验室，贵州大学生物农业工程学院与生命科学学院，中国贵阳550025

摘要

土壤和水中的砷（As）污染严重限制了植物生产力，并威胁食品安全和生态系统健康。为了评估真菌砷转运蛋白在提高植物耐砷性方面的潜力，我们利用酵母异源表达系统和转基因烟草植物对来自Coprinellus disseminatus的CdACR3进行了功能鉴定。在酵母中过表达CdACR3显著增强了其在砷酸盐胁迫下的生长和存活能力，证实了其在砷解毒中的作用。在烟草中，CdACR3的异位表达显著提高了植物的耐砷性，表现为生长增强、抗氧化酶活性提高（SOD、POD、CAT增加）、氧化损伤降低（MDA减少）以及叶绿体和线粒体超微结构的更好保存。与野生型植物相比，转基因植株在砷酸盐暴露下积累的砷较少，并且根到茎的转运减少。砷形态分析进一步表明CdACR3促进了砷（III）从根部向外部介质的排出，从而限制了砷在植物组织中的积累。转录组分析显示CdACR3的表达主要富集了与苯丙素生物合成、谷胱甘肽代谢和黄酮类生物合成相关的通路，包括与木质素形成（NtCAD、NtCCR）、谷胱甘肽代谢（NtGST）和黄酮类合成（NtHCT）相关的基因。总体而言，这些结果表明CdACR3通过协调亚砷酸盐的排出、氧化还原平衡和细胞壁强化来提高植物的耐砷性，为培育具有增强耐砷性和减少砷积累的作物提供了新的证据。

引言

砷（As）是一种广泛存在于环境中的有毒类金属，对生态系统和人类健康构成重大风险（Sandhu等人，2025年；Zhang等人，2022年）。采矿、冶炼以及含砷农化产品的使用等人活动加剧了全球土壤和水体的砷污染（Teng等人，2024年）。植物从环境中吸收砷并将其积累在可食用组织中，使其进入食物链（Ulhassan等人，2022年）。长期通过受污染的食物和水接触砷与严重的健康问题有关，包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病（Rehman等人，2021年）。因此，了解植物中砷的吸收、转运和解毒机制对于开发减少作物中砷积累的策略至关重要（Zhang等人，2021年）。在土壤中，砷主要以无机砷酸盐[As (V)]和亚砷酸盐[As (III)]的形式存在。As (V)作为一种磷酸盐类似物，通过磷酸盐转运蛋白被植物细胞吸收（Sun等人，2024年）。一旦进入细胞，As (V)会迅速被还原为更具毒性和反应性的As (III)（Dai等人，2022年），后者通过Nodulin 26样内在蛋白（NIP）家族的水甘油孔进入细胞（Khan等人，2021年）。为了对抗砷的毒性，植物进化出了解毒机制，包括通过富含硫醇的肽（如植物螯合素）螯合As (III)并随后将其隔离在液泡中（Gupta等人，2024年）。一些植物还将As (III)从根细胞排出到外部环境中，减少其向地上组织的转运（Frémont等人，2024年）。然而，与微生物相比，植物中介导亚砷酸盐排出的分子成分仍然知之甚少（Zhang等人，2022年）。

在微生物中，亚砷酸盐的排出是一种关键的抗性机制。亚砷酸盐转运蛋白ACR3（Arsenite transporter 3）在细菌、酵母和真菌中普遍存在，它能够将As (III)从细胞质主动排出到细胞外空间（Mizio等人，2023年）。ACR3介导的排出减少了细胞内的砷积累并增强了细胞对砷胁迫的耐受性（Wang等人，2024年）。在酵母和真菌中，ACR3蛋白在砷解毒中起着核心作用（Li等人，2024年）。值得注意的是，高等植物中几乎不存在ACR3的同源物，这表明将微生物的ACR3基因引入植物可能提供一种增强耐砷性和减少砷积累的新策略（Zhao等人，2024年）。最近的基因工程研究旨在调节植物中的砷吸收、转运和解毒途径，以减少砷积累并提高耐受性（Kumar等人，2022年）。例如，过表达来自超积累砷的蕨类植物Pteris vittata的PvACR3增强了砷从根部向茎部的转运及其在叶片中的隔离（Li等人，2024年）。然而，利用异源转运蛋白促进植物中亚砷酸盐排出以减少砷积累的研究仍然有限。因此，鉴定和功能鉴定植物中高效的亚砷酸盐转运蛋白对于开发新的解毒策略具有重要意义。

在这项研究中，我们从Coprinellus disseminatus中克隆了一个CdACR3基因，并优化了其编码序列以适应植物表达。在酵母中的功能验证表明，天然CdACR3的表达在砷胁迫下改善了生长，这一点通过斑点测定和生长曲线分析得到了证实。随后，通过Agrobacterium介导的转化将经过密码子优化的CdACR3引入烟草（Nicotiana tabacum）。通过评估转基因烟草在砷胁迫下的生长表现、砷积累和As (III)排出能力，本研究旨在阐明异源CdACR3转运蛋白在植物砷解毒中的作用，并提供一种潜在的基因工程策略来减少植物中的砷积累。

章节片段

真菌菌株、植物材料和试剂

野生型Coprinellus disseminatus菌株（保藏号5.797）最初从贵州省毕节市富砷土壤中分离出来，保存在广东省微生物文化中心（GDMCC，www.gdmcc.net）。Nicotiana tabacum ‘Xanthi’由贵州烟草科学研究所以及提供。试剂包括：植物表达载体pCAMBIA1301（VT4039，BT实验室，中国）、MiniBEST质粒纯化试剂盒v4.0（9760，Takara，日本）、卡那霉素（69–52–3，Merck）。

结果

为了评估真菌类型的亚砷酸盐转运蛋白是否能在高等植物中发挥作用，选择了来自C. disseminatus的CdACR3进行功能分析。与已经在多个异源系统中研究过并与砷转运或隔离改变相关的PvACR3（来自超积累砷的P. vittata）不同，真菌ACR3蛋白通常被认为是一种更经典的微生物类型的As(III)排出系统。此外，C. disseminatus是一种耐砷真菌

CdACR3增强了酵母细胞的耐砷性

结论

总之，本研究系统地阐明了真菌来源的砷转运蛋白CdACR3在增强植物耐砷性方面的功能和作用机制。在酵母中的异源表达实验表明CdACR3显著增强了细胞在砷胁迫下的生长，验证了其作为As(III)排出转运蛋白在砷解毒中的关键作用。在烟草中的进一步功能表征显示，CdACR3的异源表达

CRediT作者贡献声明

秦丽军：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。陈江红：撰写——初稿，数据管理。

参与同意

所有作者均同意参与本研究。

伦理批准

不适用。

资助

该项目没有获得任何资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。