《Plant Physiology and Biochemistry》：Regulation of Light-induced Anthocyanin Biosynthesis in Sweet Cherry by the WRKY Transcription Factor PavWRKY18
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花青素（anthocyanin）的产生与积累是决定甜樱桃（Prunus avium）果实色泽与品质的关键因素。尽管WRKY转录因子（transcription factor）被认为是次级代谢的重要调控因子，但其在甜樱桃着色中的具体作用与机制仍不清楚。通过对不同
花青素（anthocyanin）的产生与积累是决定甜樱桃（Prunus avium）果实色泽与品质的关键因素。尽管WRKY转录因子（transcription factor）被认为是次级代谢的重要调控因子，但其在甜樱桃着色中的具体作用与机制仍不清楚。通过对不同成熟阶段及光照处理下甜樱桃的比较转录组分析，研究人员鉴定出候选基因PavWRKY18。PavWRKY18的表达模式表现为在果实成熟后期特异性高表达，并与光照呈强正相关。通过在甜樱桃果实中进行PavWRKY18的过表达（overexpression）与沉默（silencing），功能表征表明PavWRKY18在果实着色和花青素（anthocyanin）积累中起光诱导的正调控作用。整合转录组分析进一步揭示，在PavWRKY18-OE2果实中，果实光介导相关基因显著改变。分子实验证明PavWRKY18蛋白直接结合花青素生物合成关键结构基因（PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavUFGT）启动子中的W-box顺式元件（cis-element），从而激活其转录。研究结果阐明了一个分子机制：光诱导的PavWRKY18通过直接靶向多个结构基因正调控花青素生物合成与积累，这为甜樱桃果实色泽改良育种提供了靶标。
研究背景：甜樱桃（Prunus avium）是高价值温带核果，其果皮颜色是成熟度与品质的首要指标，主要由花青素（anthocyanin）的生物合成与沉积决定。花青素生物合成途径的结构基因（structural gene）及MYB–bHLH–WD40（MBW）等转录调控机制在多种植物中已有研究，但WRKY转录因子（WRKY transcription factor）在甜樱桃果实着色中的具体功能与直接靶标仍不明确，且甜樱桃全基因组PavWRKY家族尚未系统鉴定。鉴于光照是诱导花青素合成的关键环境信号，而袋遮光抑制、去袋复照可快速改变色素积累，研究人员开展此项研究以明确PavWRKY家族组成，筛选光响应且成熟后期高表达的PavWRKY成员，并解析其直接调控花青素结构基因的分子机制，成果发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。
主要关键技术方法：研究人员首先对甜樱桃参考基因组进行基于BLAST与隐马尔可夫模型（HMM）的PavWRKY家族全基因组鉴定与系统进化分类；利用两个品种（‘Binhu’与‘Isabella’）五个成熟阶段的转录组及‘Hong deng’品种袋遮光（S-Br30）、去袋复照（R-Br30）与正常光照对照（L-Br30）的转录组数据进行表达模式筛选；采用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时转化在甜樱桃果实中进行PavWRKY18过表达（OE，载体pBI121）与病毒诱导的基因沉默（VIGS，载体pTRV2）并测定表型与代谢产物（总花青素、总类黄酮、可溶性糖、可滴定酸及LC-MS定量单体花青素）；通过亚细胞定位确认核定位；利用RT-qPCR（实时荧光定量PCR）验证基因表达；对OE果实进行转录组测序与KEGG富集分析；采用双荧光素酶报告实验（dual luciferase reporter assay）、酵母单杂交（yeast one-hybrid assay）及电泳迁移率变动分析（EMSA）验证PavWRKY18与靶基因启动子W-box的直接结合与转录激活能力。
3.1. Analysis of PavWRKY gene family classification and evolution in sweet cherry：研究人员通过BLAST与HMM鉴定出61个PavWRKY转录因子，依据最大似然法（Maximum Likelihood）系统进化树比对拟南芥（Arabidopsis thaliana）同源蛋白进行命名与分组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，Ⅱ组再分Ⅱa-Ⅱe亚组），MEME motif分析显示各组具特征保守基序（motif 1–2含WRKY域与锌指结构，motif 5限于Ⅱa/Ⅱb，motif 6限于Ⅱe），蛋白理化预测均无典型细胞器靶向肽，提示核定位转录调控功能。
3.2. Specific Expression Profiles of the PavWRKY Gene Family：基于两品种五个成熟阶段转录组，聚类将高表达PavWRKY（FPKM>10）分为后期高表达（Group I，含PavWRKY18等6个）、早期高表达（Group III）及无特异模式组；基于遮光/复照转录组分为遮光前无高表达（Group I）、复照不上调（Group II）及光响应特异组（Group III，含PavWRKY18等12个）；整合得出PavWRKY18在成熟后期上调且与品种色泽差异相关，其启动子含光响应顺式元件（cis-element），确定为光诱导且在成熟着色关键候选。
3.3. Effect of PavWRKY18 on Sweet Cherry Fruit Coloration：亚细胞定位显示PavWRKY18-eGFP与核标记mCherry重叠，证实核定位；果实瞬时OE使PavWRKY18表达显著升高（OE2更明显），VIGS显著敲低；OE果实颜色更深红，VIGS更绿；OE提升可滴定酸、可溶性糖、总花青素、总类黄酮，VIGS显著降低总花青素与总类黄酮，表明PavWRKY18正调控果实成熟相关性状与花青素积累。
3.4. Impact of PavWRKY18 on Genes Expression：对PavWRKY18-OE2与空载体果实转录组测序，PCA区分两组，鉴定出3413个显著上调、3601个下调DEG；KEGG富集显示涉及光合作用、次级代谢物生物合成、光合天线蛋白、氧化磷酸化、昼夜节律、其他聚糖降解、淀粉与蔗糖代谢、萜类骨架生物合成、植物激素信号转导、MAPK信号等通路，提示PavWRKY18影响光信号、次级代谢、糖酸代谢及激素相关转录重编程。
3.5. Impact of PavWRKY18 on Anthocyanin Biosynthesis：OE果实中花青素途径关键结构基因PavCHS、PavF3'H、PavF3H、PavDFR、PavANS、PavUFGT、PavGST表达均高于对照（转录组热图与RT-qPCR验证，除PavCHI、PavF3'H无显著差异）；LC-MS定量四种主要花青素：氰啶-3-O-芸糖苷（Cy3R）、氰啶-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）、天竺葵啶-3-O-芸糖苷（PG3R）、天竺葵啶-3-O-丙二酰芸糖苷（PN3R）在OE显著升高，VIGS显著降低，证实PavWRKY18促进花青素单体与总量积累。
3.6. PavWRKY18 regulates the expression of pivotal anthocyanin-biosynthetic genes：RT-qPCR验证OE中PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavANS、PavUFGT、PavGST显著上调，VIGS下调（PavCHI、PavF3'H无显著变化）；启动子（2000 bp）扫描显示PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavUFGT、PavANS、PavGST中含W-box（TTGACC/T）元件，提示其为WRKY直接靶标。
3.7. Regulation of PavWRKY18 on the transcriptional levels of anthocyanin synthesis genes：双荧光素酶报告实验显示PavWRKY18与对照空载体相比显著激活PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavUFGT的启动子驱动LUC/REN比值（荧光成像一致），而对PavANS、PavGST启动子无显著直接激活，表明PavWRKY18直接转录激活部分结构基因而非全部上调基因。
3.8. Binding of PavWRKY18 to Promoters of Anthocyanin-Pathway Genes：酵母单杂交中PavWRKY18-AD与含PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavUFGT启动子的AbAi报告菌株在对应AbA（金担子素A）浓度下生长，阴性对照（空AD）不生长，阳性对照正常，证实体内直接结合；EMSA显示纯化PavWRKY18-GST蛋白与含W-box（TTGACC）的生物素标记探针形成滞后带，过量冷探针竞争消除滞后，突变W-box（AAAAAA）探针不能竞争，证实体外特异性结合W-box并直接调控这四个基因。
讨论部分总结：研究人员指出本次在甜樱桃中鉴定出61个PavWRKY转录因子并完成系统分类；表达筛选确定PavWRKY18为成熟后期高表达且光诱导的成员；功能实验证明PavWRKY18正调控果实着色、花青素与类黄酮积累及糖酸成熟相关性状；转录组富集提示其还关联光信号、激素（如ABA、JA）、MAPK及糖代谢通路，与其他物种中WRKY参与糖响应、激素介导成熟调控相吻合；分子机制上PavWRKY18直接结合PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavUFGT启动子W-box并转录激活，为多基因直接靶向模式，不同于仅通过MBW复合体间接调控的WRKY；PavANS与PavGST在OE中上调但无直接启动子激活，暗示为间接代谢流或全局调控结果；此多结构基因协调激活可解释花青素单体与总量显著提升；讨论提出未来需研究PavWRKY18上游光信号与是否互作MYB/bHLH以完善网络。结论部分翻译：本研究揭示PavWRKY18是甜樱桃中光响应的花青素生物合成激活因子。通过直接结合关键结构基因PavCHS、PavF3H、PavDFR、PavUFGT启动子中的W-box基序，PavWRKY18协调上调整个花青素途径，导致色素积累显著增强与果实色泽更优。瞬时过表达与VIGS功能验证显示表达量与花青素、总类黄酮成正相关。除花青素合成外，转录组数据提示PavWRKY18可能参与葡萄糖代谢、激素信号与光响应，在果实成熟中起综合作用。利用PavWRKY18进行定向育种或生物技术操作，为提高甜樱桃果实着色与整体品质提供了可行途径。
