《Plant Physiology and Biochemistry》：Alternative transcription initiation and termination and its control through epigenetic marks in rice revealed by Nanopore RNA sequencing
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基因转录是一个复杂的过程。替代转录起始（Alternative Transcription Initiation，ATI）与替代转录终止（Alternative Transcription Termination，ATT）有助于转录组的复杂性，进而导致蛋白质组
基因转录是一个复杂的过程。替代转录起始（Alternative Transcription Initiation，ATI）与替代转录终止（Alternative Transcription Termination，ATT）有助于转录组的复杂性，进而导致蛋白质组的结构与功能多样性。ATI和ATT的研究主要在动物中开展，而在植物中鲜有报道。本研究利用Nanopore平台进行全长RNA测序，鉴定了水稻小花发育阶段的新转录本及组织特异性转录本、ATI和ATT事件，揭示了水稻转录组的多样性。三个小花发育阶段间差异表达的ATI凸显了转录起始（Transcription Initiation，TI）位点选择在发育转换中的重要性。整合DNA甲基化数据分析发现，ATI和ATT位点的选择与低DNA甲基化水平显著相关。此外，发生ATI/ATT事件的基因与高度开放的染色质状态显著相关。综上所述，Nanopore测序在获取全长新转录本方面具有优势，可改进水稻基因组的注释与准确性。整合分析表明，上述表观遗传标记可调控TI和TT（Transcription Termination，转录终止）位点的选择，从而导致水稻转录组的复杂性。
水稻中由表观遗传标记调控的替代转录起始与终止——基于Nanopore RNA测序的研究解读
本文发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。
一、研究背景
水稻产量受遗传与表观遗传因子共同影响，虽然二代测序已用于更新水稻基因组注释，但其短读长难以覆盖完整转录本。PacBio等长读长平台改善了粳稻基因组注释，但对水稻生殖组织不同发育阶段的全长转录本分析仍较缺乏。Oxford Nanopore技术可直接测序全长RNA分子，是研究转录组复杂性的有力工具。替代转录起始（Alternative Transcription Initiation，ATI，主要指5′UTR及上游灰区出现多个转录起始位点）与替代转录终止（Alternative Transcription Termination，ATT，主要指3′UTR及下游灰区出现多个转录终止位点）在动物中被证实广泛存在且贡献于转录组和蛋白质组多样性，表观遗传标记（DNA甲基化、染色质状态）可影响ATI/ATT位点选择，但植物尤其是水稻中ATI/ATT与表观遗传标记的关联尚不清楚。因此，研究人员利用Nanopore RNA测序结合全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）和ATAC测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，染色质可及性测序），探究水稻花发育过程中ATI/ATT事件及其与DNA甲基化和染色质可及性的关系。
二、主要关键技术方法
研究人员以籼稻品种4266（Oryza sativa Indica）为材料，采集三个发育阶段花序组织——幼穗（Young Panicles，YP，长3～10 mm）、未受精小花（Unfertilized Florets，UF，开花前）和受精后6 h小花（Fertilized Florets，F）——各设至少两至三个生物学重复。主要技术方法包括：(1) Nanopore直接RNA建库与全长RNA测序（Minimap2比对至MSU7.0参考基因组，鉴定新转录本、ATI及ATT）；(2) 全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）检测CG、CHG、CHH上下文DNA甲基化水平；(3) ATAC测序检测启动子及转录终止位点附近染色质可及性；(4) 基于DESeq2鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）与差异表达转录本（Differentially Expressed Transcripts，DETs）；(5) RT?qPCR验证ATI与ATT事件。
三、研究结果
Nanopore enables the identification of novel transcripts（Nanopore可鉴定新转录本）
研究人员将Nanopore测序读段比对至水稻MSU7.0基因组，共鉴定到10,067条匹配6,710个已知基因的新异构体（isoform），以及源自1,214个新基因的1,633条新异构体。新转录本显著富集于核糖体、剪接体和RNA转运等KEGG通路，说明生殖器官发育期间代谢活跃。
Reproductive-tissue specific transcripts compared with seedling（与幼苗相比的生殖组织特异性转录本）
与已发表的水稻幼苗PacBio全长cDNA数据比对，研究人员鉴定到6,479条仅在生殖组织中检测到的转录本（其中1,389条源自未注释基因）。这些生殖组织特异性转录本显著富集于核糖体、氧化磷酸化、RNA聚合酶及剪接体通路，表明其在植物有性生殖及配子细胞命运调控中的特殊作用；转录因子家族分析也显示特定TF家族在生殖组织中特异表达。
Identification of differentially expressed transcript (DET) and differentially expressed gene (DEG)（差异表达转录本与差异表达基因的鉴定）
基于CPM值分析，F样品转录本及基因的表达累积频率高于YP和UF，说明三阶段转录组谱不同。比较分析共鉴定到UF vs YP的11,672个DETs（对应6,692个基因）和F vs UF的5,915个DETs（对应3,242个基因）；相应DEGs分别为7,667和4,091个。大多数具DETs的基因同时也为DEGs（F vs UF中约81.15%的DET基因亦为DEG）。UF相对于YP上调基因富集于碳代谢、淀粉与蔗糖代谢及苯丙烷类生物合成；F相对于UF上调基因富集于核糖体通路。
Alternative transcription initiation (ATI) contributes to rice transcriptome diversity（替代转录起始贡献于水稻转录组多样性）
在全时期共鉴定到源自643个基因的876个ATI事件。UF vs YP比较中，UF中259个ATI转录本上调、310个下调；F vs UF比较中，F中341个上调、256个下调。UF中上调ATI富集于脂质转运与定位，下调ATI富集于核糖体结构组分及翻译；F中上调ATI同样富集于核糖体相关条目。部分基因（如LOC_Os01g05430）呈现组织特异性ATI模式（YP和UF中有，F中缺失），新转录本弥补了MSU7数据库注释不足。
Alternative transcription termination (ATT) is widely distributed in the rice transcriptome（替代转录终止广泛分布于水稻转录组）
研究人员共鉴定到源自4,028个基因的5,605个ATT事件，ATT发生密度高于ATI。UF vs YP中上调ATT富集于膜、定位与转运，下调ATT富集于核糖体相关基因；F vs UF中上调ATT富集于核糖体蛋白编码基因，下调ATT富集于信号转导相关条目。以LOC_Os06g40990（编码信号肽，兼具ATI与ATT）为例，Nanopore检测结果与RT?qPCR验证一致，证实Nanopore对ATI/ATT的识别具有高准确性。
Decreased DNA methylation around TSS is correlated with the production of ATI（转录起始位点周围DNA甲基化降低与ATI产生相关）
整合WGBS数据，以无ATI基因的随机外显子为对照，分析ATI基因转录起始位点（Transcription Start Site，TSS）上下游各0.5 kb及全长基因区（含转录终止位点Transcription End Site，TES下游2 kb）的DNA甲基化。结果显示：ATI事件关联的TSS侧翼区域CG和CHG甲基化水平显著降低，基因本体及TES下游亦呈低CG/CHG甲基化；而CHH甲基化在ATI基因全结构域高于对照。说明低CG/CHG甲基化与ATI相关，CHH甲基化则可能发挥不同调控作用。组织特异性ATI基因DNA甲基化模式亦区别于其他组织。
DNA methylation status was associated with the ATT events（DNA甲基化状态与ATT事件相关联）
分析含ATT基因在TES周围的甲基化谱发现：CG和CHG甲基化在TES附近显著降低（与无ATT对照比），而CHH甲基化在TES本身与对照相似，侧翼则升高。TSS附近的ATT基因CG和CHH略降，CHG显著降低。将表达基因按是否发生ATI/ATT及组织特异性分三簇，发生ATI或ATT的基因整体DNA甲基化水平显著低于不发生ATI/ATT的基因。
Chromatin accessibility was associated with the production of ATI and ATT（染色质可及性与ATI和ATT的产生相关）
对YP进行ATAC测序，发现在TSS（-0.5～+0.5 kb）区域，发生ATI的基因其ATAC信号（染色质可及性）显著高于随机无ATI基因；ATT基因TSS附近ATAC信号亦轻度升高，整体开放染色质与ATI/ATT事件显著正相关（Wilcoxon秩和检验），表明染色质开放性促进ATI和ATT的发生。
四、讨论与结论总结
研究人员讨论指出，Nanopore直接RNA测序能发现MSU7数据库中缺失的新转录本、ATI及ATT事件，其中ATT事件数量多于ATI，说明ATT对水稻转录组复杂性影响更大。鉴定到的6,479条生殖组织特异性转录本富集核糖体及剪接体相关基因，为有性生殖调控提供了新资源。差异表达ATI/ATT尤其是UF与F之间的差异，凸显TI/TT位点选择在发育转换中的作用；受精后上调的ATI/ATT富集核糖体途径，暗示其参与受精后有性生殖相关基因翻译增强。
关于表观遗传调控：ATI基因TSS周围CG和CHG甲基化降低与ATI发生相关，CHH甲基化反而升高，提示不同胞嘧啶序列背景的DNA甲基化在ATI位点选择中功能不同；ATT基因的TES周围CG和CHG甲基化同样降低，CHH模式不同于CG/CHG。染色质可及性分析显示ATI和ATT位点均伴随更高的开放染色质信号。综上，DNA甲基化（CG、CHG的低甲基化及CHH的特殊模式）与染色质可及性共同调控水稻中ATI与ATT事件的发生与位点选择，从而导致水稻转录组复杂性增加。Nanopore全长RNA测序联合WGBS与ATAC测序为植物转录起始/终止可变事件及其表观遗传调控机制研究提供了有效范式。
