含有生物活性玻璃和铜纳米结构的近红外响应型可注射水凝胶用于光热抗菌及牙周炎治疗

《Nano Select》：Near Infrared Responsive Injectable Hydrogel with Bioactive Glass and Copper Nanostructures for Photothermal Antibacterial and Periodontitis Treatment

　　

本研究开发了一种基于氧化海藻酸钠（oxidized sodium alginate, Alg-OX）和明胶的多功能可注射水凝胶，其掺入了铜-单宁酸（copper-tannic acid, CuT）纳米结构和生物活性玻璃（bioactive glass, BG），旨在协同实现感染控制与牙周缺损的治疗。该水凝胶表现出固有的抗菌活性，同时BG具有释放骨传导离子、促进组织矿化的潜力。在近红外（near-infrared, NIR）辐照下，水凝胶表现出光热转换效应，通过局部温和热疗对伴放线聚集杆菌（ Aggregatibacter actinomycetemcomitans）发挥抗菌作用。该水凝胶对革兰氏阳性菌亦表现出抗菌效果，但作用相对较弱。选择性靶向革兰氏阴性菌可最小化对有益革兰氏阳性共生菌的干扰，从而维持口腔微生物平衡并降低继发性菌群失调的风险。此外，该水凝胶表现出良好的可注射性、生物相容性，以及支持细胞存活和迁移的能力。这些整合功能使水凝胶能够有效抑制细菌定植并加速牙周组织再生。综上所述，该复合水凝胶具有用于牙周炎治疗的潜力，兼具生物相容性、抗菌性及潜在的再生特性。

牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，以牙周支持组织的破坏为特征，包括结缔组织崩解和进行性牙槽骨丧失，最终导致牙齿稳定性受损。除影响口腔功能和美观外，牙周炎还与糖尿病和心血管疾病等全身性疾病相关。该疾病的发生源于微生物活动与宿主免疫调节紊乱之间复杂的相互作用，导致持续感染、结缔组织降解和愈合受损。

多种病原菌被认为参与牙周炎的发病机制，包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）。其中，伴放线聚集杆菌因其毒力因子及逃逸免疫清除的能力，常与侵袭性牙周炎相关。尽管传统的治疗方法如洁治和根面平整、抗生素应用以及引导性组织再生旨在减少细菌负荷并恢复组织功能，但在深牙周袋、生物膜抗性及复杂骨缺损等部位，其疗效可能受限。

可注射水凝胶作为牙周应用领域的有前景的生物材料脱颖而出，因其能够以微创方式递送，适应不规则的缺损几何形态，并作为治疗或再生因子的局部载体。在牙周缺损治疗背景下，双重功能尤为重要，即生物材料不仅需要抑制病原菌定植，还需为组织愈合和矿化组织再生提供有利的微环境。基于此，研究人员设计了以氧化海藻酸钠（Alg-OX）和明胶为主要基质形成聚合物的多功能复合水凝胶。海藻酸钠具有良好的生物相容性、亲水性，广泛应用于组织工程和再生医学领域；而明胶则提供了来源于胶原的、具有生物学优势的基质。氧化海藻酸钠与明胶可通过醛基与氨基之间的席夫碱（Schiff-base）反应形成动态可注射水凝胶，实现温和凝胶化并适应不规则缺损。研究人员进一步引入硼砂（borax），通过可逆的硼酸-二醇相互作用稳定网络结构，并在形变后支持结构恢复。

为引入抗菌和光热功能，研究人员将铜-单宁酸（CuT）纳米结构掺入水凝胶。铜离子已被报道可通过调节内皮细胞活性并上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）相关信号通路来促进血管生成，同时还表现出通过膜破坏、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生和酶抑制等机制发挥内在抗菌活性。此外，铜基纳米结构能够高效将近红外（near-infrared, NIR）光转换为局部热量，从而实现光热抗菌作用。这些特性使铜成为对抗牙周病原菌（包括伴放线聚集杆菌）的有吸引力的功能组分。然而，不受控制的铜释放可能诱导细胞毒性，因此需要能够调节其生物利用度的载体系统。

单宁酸（tannic acid, TA）被选为配位多酚以稳定铜基纳米结构，并通过金属-酚相互作用调节铜的利用度。除具有强大的金属螯合能力外，单宁酸本身具有生物活性，据报道可提供抗氧化、抗炎和抗菌 effects。所得的CuT纳米结构表现出类似纳米酶（nanozyme）的活性，具有酶促清除ROS和免疫调节功能，有利于缓解慢性炎症。

与此同时，研究人员引入生物活性玻璃（bioactive glass, BG）作为无机再生相，因其离子溶解产物可支持矿化、成骨活性及缺损环境中的组织整合。BG释放具有生物学活性的离子，可刺激成骨细胞增殖、基因表达及骨相关再生反应。此外，当掺入水凝胶系统时，BG可进一步增强支架生物活性，促进与牙周缺损周围组织的更好整合。

本研究中，研究人员开发了掺入CuT金属-酚网络（metal-phenolic network, MPN）和BG的多功能可注射水凝胶，以应对牙周炎中感染控制和组织再生的双重挑战。各组分被赋予特定功能：海藻酸钠提供生物相容性亲水骨架用于水凝胶形成和可注射性；明胶贡献支持细胞黏附的基序；硼砂形成动态可逆交联以增强可注射性和结构恢复；BG促进矿化并支持骨再生；Cu²⁺/单宁酸则赋予抗菌、光热及潜在抗氧化功能，同时改善网络稳定性。所得水凝胶表现出良好的生物相容性、抗菌活性及体外支持细胞迁移的能力。总体而言，该整合系统结合了结构适应性、生物活性和感染控制，突显了其在牙周缺损再生中的潜力。

**CuT纳米结构的表征**

研究人员通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和zeta电位测量分析了CuT纳米结构的水动力学尺寸分布和表面电荷。DLS结果表明纳米颗粒主要水动力学直径约为500–600 nm，呈单峰分布，表明CuT纳米颗粒的成功形成；适中的多分散指数（polydispersity index, PDI）表明相对均匀的粒径分布和最小程度的聚集。Zeta电位分析显示纳米颗粒具有强负表面电荷（约?40.00 ± 5.8 mV），表明纳米颗粒间存在显著的静电排斥，预示良好的胶体稳定性和抗聚集能力。TEM（transmission electron microscopy）图像揭示了纳米结构的板状形态，平均长度约150 nm。DLS与TEM测量结果的差异源于两种技术的不同原理：DLS测量水溶液中CuT纳米颗粒的水动力学直径，包含水化层和表面结合的单宁酸，导致表观尺寸较大；而TEM提供纳米颗粒的干态核心尺寸。

**氧化海藻酸钠（Alg-OX）的表征**

研究人员通过高碘酸钠（NaIO₄）氧化海藻酸钠合成Alg-OX，将相邻的二醇基团转化为醛基。FT-IR（Fourier transform infrared spectroscopy）光谱分析显示，Alg-OX在1735 cm^?1附近出现新峰，对应于醛基的C═O伸缩振动，证实了Alg-OX的成功合成。同时，3000–3500 cm^?1区域羟基伸缩振动强度降低，1081 cm^?1附近峰强度降低归因于环醚形成，表明聚合物链的部分断裂。¹H NMR（proton nuclear magnetic resonance spectroscopy）光谱中，Alg-OX在约5.3和5.6 ppm处出现两个新峰，归属于醛基及其邻近羟基形成的半缩醛质子，直接证实了海藻酸钠的成功氧化。采用Gomez法测得Alg-OX的氧化度（degree of oxidation, DO）为16%。

**可注射水凝胶的表征**

水凝胶的形成、自修复能力和可注射性方面，Alg-OX/硼砂/明胶/生物活性玻璃/CuT水凝胶通过氧化海藻酸钠与明胶的席夫碱连接制备，CuT纳米颗粒在该系统中形成氢键。最终水凝胶通过简单混合Alg-OX/硼砂/CuT和明胶/生物活性玻璃溶液获得。由于席夫碱键的存在，该水凝胶具有自修复能力，切割后在24小时内可于切割点处修复。可注射性测试显示，凝胶样品在完全形成后可置于5 mL注射器中并连续挤出，由于剪切应力作用，凝胶成功通过针头而不堵塞，证明其剪切稀化（shear-thinning）特性。

FT-IR光谱分析确认，Alg-OX的羟基红外吸收峰（3000–3500 cm^?1）因阴离子硼酸盐的相互作用而变得钝化和宽化。明胶与生物活性玻璃混合后，1392 cm^?1处的峰表明明胶羧基与生物活性玻璃Ca²⁺离子之间形成化学键。最终水凝胶光谱中1697 cm^?1处新峰的出现与高效的席夫碱形成一致。

流变学（rheology）测试表明，Alg-OX/硼砂/明胶水凝胶的储能模量（storage modulus, G′）高于损耗模量（loss modulus, G″），表明凝胶状态；G′_max为14,300 Pa。加入生物活性玻璃后模量降低（G′_max = 6010），但仍保持G′ > G″的凝胶状态。进一步加入CuT纳米颗粒后，G′_max略增至6930 Pa，这是由于CuT的羟基可与水凝胶网络中的活性基团（如海藻酸钠或明胶中的羟基）反应形成新的氢键和化学键，从而增强聚合物网络。

SEM（scanning electron microscopy）图像显示水凝胶具有多孔且粗糙的表面形态，有利于干细胞黏附和细胞有序组织。EDS（energy-dispersive X-ray spectrometry）元素分析和面扫描确认了CuT和生物活性玻璃在水凝胶基质中的成功掺入和均匀分布。

**体外光热活性**

在808 nm、1.5 W cm^?2条件下，CuT纳米颗粒和Alg-OX/硼砂/明胶/生物活性玻璃水凝胶的光热活性研究表明，Alg-OX/硼砂/明胶/生物活性玻璃/CuT水凝胶在四次NIR辐照循环后表现出稳定的开关效应，表明其可通过水凝胶基质内的铜纳米颗粒通过等离子体激发或量子光子吸收有效吸收并转换808 nm光为热能。强NIR吸收和良好的光活性使该水凝胶极具光热治疗应用前景。

**水凝胶的溶胀行为**

溶胀行为分析显示，生物活性玻璃和CuT纳米颗粒的加入降低了水凝胶的溶胀能力，这归因于额外的氢键形成和交联密度增加，限制了水分吸收。然而，这种控制性溶胀行为具有显著优势：减少过度溶胀使水凝胶保持机械稳定性，防止应用过程中的结构解体，确保持久功能。

**抗菌性能**

研究人员评估了水凝胶对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, 革兰氏阳性菌）、大肠杆菌（Escherichia coli, 革兰氏阴性菌）和伴放线聚集杆菌（Gram-negative）的抗菌活性。CFU（colony-forming unit）计数法证实水凝胶对三种菌株具有剂量依赖性光热杀菌效应。GAB-BC对大肠杆菌和伴放线聚集杆菌表现出显著抗菌活性，这可归因于静电作用力。

针对大肠杆菌，抗菌活性随浓度增加而提高，GAB-BC在50 mg/mL浓度下达到99.33%抗菌率；引入NIR辐照后，在50 mg/mL浓度下实现100%抗菌。相比之下，水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低，GAB-BC在50 mg/mL浓度下仅显示29.6%抗菌率；虽然存在浓度依赖性增强至66.89%（?NIR）和80.46%（+NIR），但整体而言对革兰氏阳性菌的抗菌能力低于革兰氏阴性菌。

针对伴放线聚集杆菌，GAB-BC的抗菌活性在NIR辐照前后均呈浓度依赖性趋势：无激光时，抗菌率从10 mg/mL的23.50 ± 1.90%增至50 mg/mL的68.77 ± 1.47%；NIR辐照后分别增至30.69 ± 1.79%、48.88 ± 0.90%和73.80 ± 0.74%。尽管激光处理提高了各浓度下的抗菌活性，但与相应未辐照组相比差异无统计学意义（p > 0.05）。最高抗菌效应出现在50 mg/mL辐照后。

牙周炎主要由革兰氏阴性厌氧菌驱动，如牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌。对革兰氏阴性菌增强的抗菌效应对牙周炎治疗尤为有利，鉴于这些感染中革兰氏阴性病原菌占主导地位。此外，通过选择性靶向革兰氏阴性菌，此类疗法可最小化对有益革兰氏阳性共生菌的干扰，维持口腔微生物平衡并降低继发性菌群失调的风险。

**抗氧化特性**

研究人员通过DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）法评估Alg-OX/硼砂/明胶/生物活性玻璃/CuT水凝胶的自由基清除能力。与水凝胶反应后观察到吸收峰降低，在517 nm处与对照相比吸收减少，表明该水凝胶显示出较低的抗氧化性能。

**细胞毒性和迁移**

MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）检测和划痕伤口愈合实验共同评估了GAB-BC水凝胶的生物相容性和生物活性。MTT实验显示GAB-BC具有良好的生物相容性，即使在5 mg/mL浓度下，与对照组相比细胞存活率相当，表明水凝胶不诱导细胞毒性效应。划痕实验结果显示，与对照组相比，GAB-BC水凝胶处理组在48和72小时时创伤闭合显著增强。这些结果表明GAB-BC水凝胶不仅生物相容，而且主动促进细胞过程，这对组织修复至关重要。两项实验的综合数据表明GAB-BC水凝胶是一种无毒的生物材料，支持细胞存活并可能促进增强的迁移行为，这对牙周再生应用至关重要。

**研究结论**

本研究成功开发了掺入CuT和BG的多功能可注射水凝胶系统用于牙周炎治疗。该水凝胶表现出生物相容性、可注射性、自修复潜力和抗菌活性。CuT的加入提供了NIR辐照下的光热抗菌能力，能够高效清除伴放线聚集杆菌同时保留有益口腔微生物群。此外，生物活性玻璃潜在释放的生物活性离子能够促进细胞迁移并支持牙周组织再生。通过物理化学表征和体外生物学评价验证了水凝胶的性能。这些发现表明该水凝胶代表了牙周炎管理的微创方法，在牙周组织再生方面具有未来应用潜力。