熊去氧胆酸通过激活ALDH3A1抑制凝血酶诱导的脂质过氧化减轻脑缺血/再灌注损伤

《Redox Biology》：Ursodeoxycholic acid mitigates cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting thrombin-induced lipid peroxidation through activation of ALDH3A1

　　

摘要：缺血性脑卒中（IS）后凝血酶（thrombin）的积累会促进脂质过氧化和铁死亡（ferroptosis），从而加剧组织损伤；然而，针对这一病理过程的有效干预措施仍然有限。尽管胆汁酸（BAs）已被证明对缺血性脑卒中具有潜在益处，但其在IS发病机制中的变化和特定作用仍知之甚少。本研究旨在进一步验证凝血酶在神经元损伤中的有害作用，探究缺血性脑卒中模型中胆汁酸谱的变化，并阐明其潜在机制。研究人员分析了小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中的血清和脑胆汁酸谱。评估了梗死体积、神经功能缺损、脂质过氧化和铁死亡。利用RNA测序探索潜在机制，随后通过药理学抑制剂进行验证。结果显示，MCAO诱导了神经元中凝血酶及其受体PAR1的上调，导致脂质过氧化、铁死亡及随后的神经元损伤。脑组织中的胆汁酸谱发生了显著改变，而熊去氧胆酸（UDCA）水平与梗死面积呈负相关。此外，补充UDCA可减轻凝血酶诱导的神经元脂质过氧化，恢复线粒体功能，抑制铁死亡，并改善神经功能结局。机制上，转录组学分析揭示了花生四烯酸代谢和醛脱氢酶3A1（ALDH3A1）表达的显著变化。研究发现UDCA上调ALDH3A1，从而减轻氧化应激和脂质过氧化——这一效应可被ALDH3A1抑制所逆转。研究人员进一步证明，UDCA通过TGR5-PKA信号通路上调ALDH3A1，该通路介导了Nrf2核转位及其随后与Aldh3a1启动子的结合。总之，UDCA通过TGR5/PKA/ALDH3A1轴在缺血性脑卒中中赋予针对凝血酶诱导的脂质过氧化的神经保护作用。这些发现将UDCA确定为缺血性脑卒中的有前景的治疗候选药物，并揭示了其神经保护作用背后的新信号机制。

**论文解读：熊去氧胆酸通过TGR5/PKA/ALDH3A1轴抑制凝血酶诱导的脂质过氧化减轻脑缺血/再灌注损伤**

**研究背景**
脑卒中（stroke）是全球性的重大健康挑战，具有高发病率和高死亡率，其中缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）占70%–80%，主要由血栓形成导致脑血管闭塞引起。凝血酶（thrombin）作为血栓形成和凝血级联反应的关键介质，在IS发病和风险中起关键作用。研究表明，脑梗死核心区的凝血酶水平是对侧区域的近两倍，其活性与梗死体积正相关，异常积累加重卒中后脑损伤。凝血酶主要通过蛋白酶激活受体1（protease-activated receptor 1, PAR1）发挥效应，过度激活引发活性氧过量产生、脂质过氧化和神经元死亡。然而，针对这一病理过程的有效干预措施仍有限。胆汁酸（bile acids, BAs）是胆固醇分解代谢的终产物，近年被认为可调节中枢神经系统（central nervous system, CNS）功能，临床和实验研究报道卒中患者胆汁酸代谢异常，特定胆汁酸如熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）在神经退行性疾病中显示神经保护作用，但IS后胆汁酸谱的具体变化及胆汁酸对抗凝血酶介导神经损伤的作用尚不清楚。醛脱氢酶3A1（aldehyde dehydrogenase 3A1, ALDH3A1）是一种NAD(P)⁺依赖性酶，可解毒内源性和外源性醛类，维持氧化还原稳态，但其在IS中的具体作用尚未明确。因此，本研究旨在评估凝血酶在IS中的表达和角色，描述卒中后胆汁酸谱的变化，并研究差异表达的胆汁酸（尤其是UDCA）对凝血酶诱导脂质过氧化的影响及其基于转录组的调控机制。

**主要技术方法**
研究人员采用小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型和HT22神经元细胞氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）及凝血酶刺激模型。使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析血清和脑组织胆汁酸谱；通过高通量RNA测序（RNA-Seq）筛选差异表达基因；利用药理学抑制剂（SCH79797抑制PAR1、ALDH3A1-IN-1抑制ALDH3A1、SBI-115抑制TGR5、H-89抑制PKA）和腺相关病毒（AAV）介导的神经元特异性ALDH3A1敲低进行功能验证；检测指标包括梗死体积（TTC染色）、神经行为学评分（modified Neurological Severity Score, mNSS）、平衡木实验、转棒实验、病理染色（HE、尼氏染色）、脂质过氧化（BODIPY^581/591 C11）、线粒体膜电位（JC-1）、活性氧（ROS）、线粒体ROS（MitoSOX Red）、线粒体呼吸链复合体I（MRCC-I）渗漏、NAD⁺/NADH比值、铁死亡相关蛋白（ACSL4、GPX4、4-HNE、TFRC、Nrf2）、染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）等。样本来源于雄性C57BL/6J小鼠。

**研究结果**
**3.1 凝血酶和PAR1在体内外缺血性脑卒中模型中上调**
通过体外HT22细胞OGD/R模型和体内MCAO小鼠模型，Western blot和免疫荧光染色显示凝血酶原、凝血酶及PAR1蛋白水平显著升高，且PAR1与神经元标志物MAP2共定位增加。PAR1拮抗剂SCH79797腹腔注射减少MCAO小鼠梗死体积，改善神经功能和运动协调，减轻HE和尼氏染色显示的病理损伤，证明凝血酶-PAR1信号加剧缺血性脑损伤。

**3.2 MCAO小鼠血清和脑组织中UDCA水平降低**
UPLC-MS/MS分析显示，MCAO小鼠血清中胆酸（CA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、α-鼠胆酸（α-MCA）、β-鼠胆酸（β-MCA）和UDCA显著降低，总胆汁酸水平下降；脑组织中仅UDCA显著降低，且血清和脑UDCA水平与梗死体积呈负相关，UDCA含量与完整神经元数量正相关（尼氏染色）。

**3.3 UDCA对MCAO诱导的脑损伤具有保护作用**
口服UDCA（60或120 mg/kg）预处理4天并持续至术后3天，可剂量依赖性减少梗死体积，降低mNSS评分，改善平衡木和转棒表现，减轻HE和尼氏染色显示的皮层病理损伤，证实UDCA补充可减轻脑损伤并改善神经功能。

**3.4 转录组分析揭示UDCA的潜在机制**
在凝血酶（8 U/mL）刺激的HT22细胞中，UDCA（100 μM）显著提高细胞活力。RNA-Seq主成分分析显示TM组与TM+UDCA组明显分离，鉴定出551个差异表达基因（DEGs），功能富集分析揭示NADPH氧化酶复合体、NAD(P)⁺核苷酶活性和花生四烯酸代谢通路富集。ALDH3A1是上调最显著的基因，直接参与脂质过氧化调控，提示UDCA可能通过ALDH3A1介导的途径发挥神经保护作用。

**3.5 UDCA上调ALDH3A1表达减轻脂质过氧化**
UDCA处理浓度依赖性地增加HT22细胞中ALDH3A1蛋白和mRNA水平。UDCA恢复凝血酶降低的NAD⁺/NADH比值，减少线粒体呼吸链复合体I（MRCC-I）渗漏。BODIPY C11和DHE染色显示UDCA减轻脂质过氧化和ROS积累；JC-1和MitoSOX Red检测显示UDCA恢复线粒体膜电位、减少线粒体超氧化物。UDCA逆转凝血酶诱导的铁死亡相关蛋白异常（上调TFRC、4-HNE、ACSL4，下调Nrf2和GPX4）。体内实验同样显示UDCA剂量依赖性增加MCAO小鼠皮层ALDH3A1表达，减少4-HNE与神经元共定位，并下调凝血酶和PAR1表达。

**3.6 UDCA通过ALDH3A1依赖性方式减轻凝血酶诱导的神经元损伤**
ALDH3A1抑制剂AL-IN-1部分抑制UDCA对ALDH3A1的上调，并消除UDCA对细胞活力、NAD⁺/NADH比值、脂质过氧化、ROS、线粒体膜电位和铁死亡相关蛋白的改善作用。脑内注射AAV-ALDH特异性敲低神经元ALDH3A1后，UDCA减少梗死体积、改善神经功能和运动协调、减轻组织病理损伤、降低ROS和铁死亡相关蛋白异常的效果均被逆转，且凝血酶和PAR1表达增加，证实ALDH3A1是UDCA神经保护的关键介质。

**3.7 UDCA通过TGR5通路调节ALDH3A1发挥神经保护作用**
UDCA处理增加HT22细胞和脑组织中TGR5蛋白和磷酸化PKA（p-PKA）水平，并剂量依赖性促进cAMP产生。TGR5拮抗剂SBI-115降低TGR5、p-PKA和ALDH3A1表达，消除UDCA对细胞活力、NAD⁺/NADH比值、MRCC-I渗漏、线粒体超微结构（TEM显示肿胀、嵴丢失）、脂质过氧化、ROS、线粒体膜电位和铁死亡相关蛋白的改善作用，表明UDCA通过TGR5依赖方式上调ALDH3A1。

**3.8 UDCA通过PKA依赖途径调节TGR5促进ALDH3A1表达**
PKA抑制剂H-89抑制UDCA诱导的PKA磷酸化和ALDH3A1 mRNA及蛋白上调，并消除UDCA对多种指标的改善作用。生物信息学预测Nrf2可能结合Aldh3a1启动子区的抗氧化反应元件（ARE）；ChIP-qPCR证实UDCA增强Nrf2与Aldh3a1启动子的结合，而H-89减少该结合及Nrf2核转位（Western blot和免疫荧光），表明UDCA通过TGR5-PKA信号促进Nrf2核转位进而激活ALDH3A1转录。

**3.9 TGR5抑制减弱UDCA对MCAO小鼠的神经保护作用**
脑室内注射SBI-115抑制TGR5后，MCAO小鼠脑内p-PKA和ALDH3A1表达下降，UDCA减少梗死体积、改善神经功能和行为学、减轻组织病理损伤、调节铁死亡相关蛋白及下调凝血酶/PAR1的效果均被显著削弱，证明UDCA的神经保护部分依赖TGR5-PKA/ALDH3A1轴。

**总结与讨论**
本研究首先证实凝血酶-PAR1信号轴是缺血性脑损伤的关键驱动因素，并发现卒中后内源性UDCA水平显著降低。补充UDCA可有效减轻凝血酶诱导的脂质过氧化、神经元死亡、梗死体积和神经功能缺损。机制上，UDCA通过激活TGR5，进而激活PKA，促进Nrf2核转位并与Aldh3a1启动子结合，上调ALDH3A1表达，从而解毒脂质过氧化产物、恢复线粒体功能并抑制铁死亡。这一TGR5/PKA/Nrf2/ALDH3A1信号轴揭示了UDCA抗脂质过氧化的新机制，并扩展了对TGR5在脑内作用的认识。该研究将UDCA定位为治疗缺血性脑卒中的有前景的临床候选药物，并阐明了其发挥神经保护作用的新信号通路。论文发表在《Redox Biology》。

**研究结论翻译**：
总之，我们的研究确立了凝血酶-PAR1信号轴作为缺血性脑损伤的关键因素，并识别出卒中后UDCA的显著降低。我们证明补充UDCA可提供强大的神经保护，减轻凝血酶诱导的脂质过氧化、神经元死亡、脑梗死体积和神经功能缺损。机制上，这种保护作用是通过一个新的TGR5/PKA/ALDH3A1通路介导的，其中UDCA激活TGR5和下游PKA信号。PKA活性随后促进Nrf2核转位及其与Aldh3a1启动子的结合，导致ALDH3A1上调并减轻有害的脂质过氧化。除了揭示ALDH3A1在神经元中先前未被认识的抗脂质过氧化功能，我们的工作还扩展了TGR5在脑内从调节凝血酶诱导的脂质过氧化到直接保护神经元氧化还原稳态的作用。这些发现不仅阐明了一个从受体激活到醛解毒的连贯信号级联，而且将UDCA和TGR5/PKA/ALDH3A1轴定位为减轻缺血性脑卒中损伤的有前景的治疗靶点。