酸性胆汁盐通过铁死亡抑制诱导APE1依赖性PRDX2激活驱动奥沙利铂耐药

《Redox Biology》：Acidic Bile Salts Induce APE1-Dependent PRDX2 Activation to Drive Oxaliplatin Resistance via Ferroptosis Inhibition

　　

背景：食管腺癌（EAC）的发病率在西方国家迅速增加。胃食管反流含有酸性胆汁盐（ABS），是EAC的主要风险因素。癌细胞通过劫持抗氧化系统来校准氧化还原平衡，从而将活性氧（ROS）维持在致死水平以下。研究人员研究了PRDX2及其在反流条件下EAC化疗耐药中的调控作用。方法：研究人员分析公共数据库，确定PRDX2在EAC中异常过表达及其在化疗耐药中的潜在作用。为模拟急性和慢性GERD的体外模型，研究人员应用短暂和重复的ABS暴露。利用EAC细胞的2D和3D器官型培养模型，研究人员研究了PRDX2的抗铁死亡、促化疗耐药功能及其调控机制。此外，研究人员还利用了患者来源的类器官和异种移植、细胞系源性异种移植以及人EAC组织微阵列。结果：在ABS暴露下，研究人员在人EAC组织和细胞系中均检测到PRDX2的异常表达。PRDX2通过APE1氧化还原依赖的NF-κB转录激活进行调控。PRDX2的敲低损害了EAC细胞从ABS诱导的ROS和ROS依赖性脂质过氧化中恢复的能力。沉默PRDX2通过增强铁死亡使化疗耐药的EAC细胞对奥沙利铂敏感。机制上，研究人员发现PRDX2通过稳定GPX4（一种关键的铁死亡抑制因子）来抑制铁死亡。PRDX2通过OTUB1依赖性去泛素化增强GPX4稳定性，防止其降解。APE1氧化还原抑制剂APX2009通过下调PRDX2并诱导铁死亡，显著使EAC细胞对奥沙利铂敏感。重要的是，奥沙利铂与APX2009的联合在异种移植模型中显示出协同肿瘤抑制作用。结论：研究人员的发现揭示了通过APE1-氧化还原/NF-κB/PRDX2/OUTB1/GPX4信号级联，反流诱导的氧化还原再平衡与铁死亡相关化疗耐药之间的新联系。通过APE1氧化还原特异性抑制剂靶向氧化还原是难治性EAC的一种潜在新型药物联合策略，通过抑制PRDX2实现。

**论文解读文章**

食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EAC）是一种在西方国家发病率迅速增加的恶性肿瘤，其五年生存率仅约22%，远处转移患者更是降至5%。慢性胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease, GERD）是EAC的主要风险因素，反流物中含有酸性胆汁盐（acidic bile salts, ABS），可导致食管下段长期暴露于高氧化应激环境。癌细胞在此条件下发展出适应性能力，通过劫持抗氧化系统来重新校准氧化还原平衡，将活性氧（reactive oxygen species, ROS）维持在致死水平以下，从而促进肿瘤进展和化疗耐药。目前EAC对化疗和靶向治疗普遍耐药，亟需开发新的治疗策略。过氧化物酶2（peroxiredoxin 2, PRDX2）是抗氧化系统中的重要成员，具有高效清除H₂O₂的能力，但其在EAC中的功能及与铁死亡（ferroptosis）的关系尚不清楚。铁死亡是一种铁依赖的程序性细胞死亡形式，由脂质过氧化累积驱动，已被证实与化疗耐药密切相关。本研究旨在揭示ABS诱导的PRDX2在EAC化疗耐药中的调控机制及铁死亡在其中扮演的角色，探索靶向氧化还原通路以逆转耐药的可能性。该研究成果发表于《Redox Biology》。

研究人员利用公共数据库（TCGA、GEO）进行生物信息学分析，结合体外2D和3D器官型培养模型、患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）及异种移植模型（patient-derived xenografts, PDXs和cell line-derived xenografts），采用基因沉默/过表达、流式细胞术（检测ROS和脂质过氧化）、免疫印迹、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）、放线菌酮追踪及泛素化实验等关键技术方法。样本队列来源包括TCGA-EAC数据库（79例EAC，9例正常组织）、GSE1420和GSE165252数据集，以及人EAC组织微阵列（tissue microarray, TMA，含35例EAC和5例正常组织）。

**研究结果：**

**3.1 PRDX2在人类EAC中过表达并被ABS诱导**
通过分析TCGA和GSE1420数据集，发现PRDX2 mRNA在EAC组织中显著高于正常食管上皮；人TMA的免疫组化染色证实PRDX2蛋白在EAC中过表达。使用急性ABS暴露模拟GERD，在OE33和SKGT4细胞中发现PRDX2 mRNA和蛋白水平在恢复期显著升高，并在3D器官型培养中进一步验证。

**3.2 PRDX2保护食管细胞免受ABS诱导的脂质过氧化和铁死亡**
ABS暴露后，细胞内ROS和脂质过氧化水平在20分钟时急剧升高，但3小时后恢复至基线。PRDX2敲低后，ROS和脂质过氧化在3小时仍维持高水平，4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）蛋白亦持续升高，表明PRDX2是清除ABS诱导氧化损伤的关键因子。

**3.3 PRDX2通过改变GPX4蛋白半衰期减轻铁死亡相关细胞死亡**
细胞活力实验显示，PRDX2敲低显著降低ABS暴露后的细胞活力，而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可部分逆转此效应。Western blot发现PRDX2敲低抑制了GPX4蛋白水平，而PRDX2过表达则升高GPX4。放线菌酮追踪实验表明，ABS延长GPX4半衰期，而PRDX2敲低缩短其半衰期，提示PRDX2通过稳定GPX4蛋白抑制铁死亡。

**3.4 PRDX2通过调节OTUB1依赖性去泛素化稳定GPX4蛋白**
公共数据库筛选显示OTUB1是PRDX2和GPX4的共同相互作用伙伴。免疫共沉淀证实三者存在相互作用。OTUB1敲低增加GPX4泛素化水平。在PRDX2敲低细胞中，OTUB1过表达可恢复GPX4蛋白水平并降低其泛素化。PRDX2过表达减少GPX4泛素化，并促进OTUB1与GPX4的结合，说明PRDX2通过招募OTUB1去泛素化GPX4来增强其稳定性。

**3.5 ABS诱导的PRDX2通过抑制铁死亡促进EAC细胞化疗耐药**
慢性ABS暴露（重复14天）使敏感的OE33和FLO-1细胞对奥沙利铂的IC₅₀显著升高，并伴随PRDX2和GPX4蛋白上调。临床数据（GSE165252）显示，化疗无应答的EAC患者中PRDX2表达高于应答者。在耐药细胞OE19和SKGT4中，稳定敲低PRDX2显著降低奥沙利铂IC₅₀，铁死亡诱导剂Erastin同样增敏。人EAC类器官中，PRDX2敲低联合奥沙利铂显著减少类器官数量和大小，并降低GPX4荧光强度。

**3.6 PRDX2在ABS暴露下受APE1调控**
TCGA和GSE165252数据库中APE1与PRDX2 mRNA呈正相关。APE1过表达上调PRDX2 mRNA和蛋白，APE1敲低则抑制ABS诱导的PRDX2上调。3D器官型培养和人EAC组织中均检测到APE1与PRDX2共定位。

**3.7 APE1氧化还原功能对ABS诱导的NF-κB依赖性PRDX2激活至关重要**
ChIP实验证实NF-κB-p65结合PRDX2启动子区域，ABS增强此结合。APE1过表达激活磷酸化p65并上调PRDX2，而NF-κB抑制剂BAY 11-7082可阻断此效应。在APE1敲低细胞中，回补野生型APE1而非氧化还原缺陷突变体（C65A）可恢复ABS诱导的p65磷酸化和PRDX2表达。APE1氧化还原抑制剂APX2009可抑制ABS诱导的p65磷酸化、PRDX2 mRNA和蛋白及GPX4蛋白水平。

**3.8 抑制APE1氧化还原功能逆转奥沙利铂耐药**
APX2009以剂量依赖方式显著降低耐药细胞OE19和SKGT4对奥沙利铂的IC₅₀。在OE19异种移植模型中，奥沙利铂联合APX2009显著抑制肿瘤生长，延长生存期，并降低Ki-67、APE1、PRDX2和GPX4表达，同时升高4-HNE水平，提示诱导铁死亡。

**总结讨论部分：** 本研究揭示了慢性GERD条件下，ABS通过激活APE1氧化还原功能，进而依赖NF-κB转录上调PRDX2，PRDX2通过招募OTUB1去泛素化稳定GPX4蛋白，从而抑制铁死亡，促进EAC细胞对奥沙利铂的耐药。逆向地，抑制APE1氧化还原活性可下调PRDX2和GPX4，增强铁死亡，克服耐药。这一发现为EAC化疗耐药提供了新的分子机制，并指出靶向APE1氧化还原功能的药物（如APX2009）具有临床转化潜力。研究结论部分翻译如下：总的来说，PRDX2通过抑制铁死亡在GERD或化疗诱导的细胞保护适应机制中发挥关键作用，赋予癌细胞内在的化疗抵抗能力。此外，研究人员的发现强调了EAC中一条新型APE1-NF-κB-PRDX2-GPX4信号轴，凸显了APE1氧化还原抑制剂和PRDX2抑制剂在克服化疗耐药、改善EAC患者预后方面的临床潜力。