靶向WIZ转录因子的基于CRBN的分子胶降解剂的发现

《Bulletin of the Korean Chemical Society》：Discovery of CRBN-based molecular glue degraders targeting WIZ transcription factor

　　

广泛间隔锌指基序（WIZ）可通过诱导胎儿血红蛋白用于镰状细胞病的治疗，是一个具有治疗潜力的靶点。本文报道了靶向WIZ转录因子的、新型基于Cereblon（CRBN）的分子胶降解剂的鉴定与优化。研究人员利用经CRISPR工程化改造的WIZ-HiBiT报告细胞，对一个以CRBN为核心的化学文库进行了高通量筛选，并鉴定出命中化合物6a；该化合物在苯并异吲哚啉酮骨架上含有N-异噁唑-3-基酰胺基团。随后，围绕酰胺的五元杂芳基取代基开展结构–活性关系研究，最终获得化合物9l（DC50?=?8.7?nM，Dmax?=?81.7%），其表现出强效的WIZ降解活性。机制研究表明，9l通过促进WIZ与CRBN之间三元复合物的形成，经由CRBN依赖性的蛋白酶体降解途径，诱导WIZ快速且持续性耗竭。重要的是，在HUDEP-2细胞中，9l介导的WIZ耗竭导致γ-珠蛋白诱导，证实了靶向WIZ降解的功能性结果。综上，这些结果界定了一类结构上有别于既往化合物的、基于CRBN的WIZ降解剂化学型，为通过药理学方式诱导γ-珠蛋白表达提供了新的骨架。

该文发表于《Bulletin of the Korean Chemical Society》，聚焦于镰状细胞病相关转录调控靶点WIZ的靶向降解策略开发。研究背景在于，WIZ是γ-珠蛋白基因HBG1/2表达的重要抑制因子，抑制WIZ可提升胎儿血红蛋白（HbF，α₂γ₂）水平，从而抑制异常血红蛋白S（HbS，α₂β^s₂）聚合并减轻镰状细胞病严重程度。因此，WIZ被视为极具前景的治疗靶点。然而，WIZ属于传统小分子抑制剂难以作用的“不可成药”蛋白类型，主要原因是其缺乏明确可成药的配体结合口袋。近年来，分子胶降解剂（MGD，molecular glue degrader）为这类靶标提供了新的干预模式。这类化合物可诱导靶蛋白与E3泛素连接酶之间形成新生蛋白–蛋白相互作用，借助泛素-蛋白酶体系统（UPS，ubiquitin-proteasome system）实现选择性降解。与不可逆基因编辑技术相比，MGD具有可逆、可调和催化式发挥作用等优势，因此在低浓度下即可产生显著药理效应，并具备发展为口服小分子药物的潜力。尽管已有WIZ靶向MGD被报道，研究人员仍致力于发现新的结构类型，以拓展该领域的化学空间并获得更优的药理学工具分子。

在方法上，研究人员首先构建了内源性WIZ C端带HiBiT标签的Jurkat报告细胞系，并基于该体系对约4000个CRBN偏向性化合物进行高通量筛选。随后围绕命中化合物开展结构–活性关系（SAR，structure–activity relationship）优化，并结合Western blot、HiBiT检测、免疫共沉淀、NanoBiT活细胞互作检测及计算分子对接分析阐明作用机制。功能层面，研究人员在HUDEP-2红系祖细胞模型中评估WIZ降解及γ-珠蛋白诱导效应；该细胞系来源于既有建立的人红系分化模型。

在研究结果部分，论文依次展示了化合物发现、结构优化、作用机制和功能验证等关键证据。

Discovery and evaluation of WIZ degraders
研究人员首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在Jurkat细胞内源性WIZ位点引入HiBiT标签，建立了适用于高通量筛选的WIZ-HiBiT报告系统。基于该体系，从约4000个化合物中筛得命中分子6a。该化合物具有N-异噁唑-3-基酰胺取代的苯并异吲哚啉酮骨架，表现出一定WIZ降解活性，其DC50为284.4?nM，Dmax为49.8%。在此基础上，研究人员围绕酰胺上的五元杂芳基开展系统SAR分析。结果显示，简单的甲基修饰或异噁唑连接位点改变会削弱活性；噻唑类似物9a则显著提升WIZ降解能力，提示邻近酰胺连接位点的氮原子在稳定三元复合物中具有重要作用。进一步比较不同二唑和三杂环取代基后，9a被确定为后续优化的先导骨架。随后，研究人员继续修饰噻唑环及引入苯并噻唑类似物。结果表明，酰胺N-甲基化的9b完全失活，说明二级酰胺N–H键对活性至关重要；噻唑5位取代总体优于4位取代，支持了位阻影响三元复合物形成的判断。在多种5位取代基中，卤素和甲氧基取代通常能够保留较高活性，而强吸电子的硝基和三氟甲基则削弱活性。最终，5-溴噻唑衍生物9l因其优良降解表现被选作重点化合物。

Computational molecular docking analysis of 9l with CRBN and WIZ
为解释9l活性增强的结构基础，研究人员采用已报道的WIZ ZF7–WIZ-6–CRBN-DDB1三元复合物晶体结构（PDB ID: 9DJX）作为模板进行计算分子对接。对接结果表明，9l的二级酰胺可与CRBN的His353形成关键氢键，这为9a与9b活性差异提供了结构学解释。此外，9l的异吲哚啉酮与噻唑基团还可与CRBN的His353形成π–π堆积作用，同时噻唑中的氮原子与WIZ的Thr871形成氢键。论文据此认为，9l通过同时与CRBN和WIZ建立协同相互作用，稳定三元复合物，进而促进WIZ泛素化及后续蛋白酶体降解。该部分结果与前述SAR观察相互印证，说明电子效应和位阻环境会显著影响噻唑氮原子的配位与复合物稳定性。

Biological evaluation of WIZ degrader 9l
在生物学评价中，研究人员通过Western blot证实9l在Jurkat细胞中具有强效WIZ降解活性，其DC50为8.7?nM，Dmax为81.7%，显著优于初始命中化合物6a。动力学实验显示，1?μM 9l处理后3?h内即可观察到快速WIZ降解，且该效应至少持续24?h，表明其降解作用既迅速又稳定。选择性分析显示，9l还可降解常见CRBN新底物CK1α，但不降解IKZF1、IKZF2和IKZF3，这一谱系与已知WIZ分子胶KMG-2937一致。与此同时，9l在HUDEP-2细胞中未见显著细胞毒性，说明其在功能实验条件下具有可接受的细胞耐受性。该部分结果确立了9l作为高效WIZ降解剂的药理学特征。

Mechanism of WIZ degradation by 9l
为明确9l介导WIZ降解的分子机制，研究人员比较了野生型与CRBN敲除Jurkat细胞对9l的响应。结果显示，CRBN缺失可完全消除9l诱导的WIZ降解，证明该效应严格依赖CRBN。随后，研究人员利用蛋白酶体抑制剂Bortezomib以及NEDD8激活酶抑制剂MLN4924进行干预，发现二者均可完全阻断9l的降解效应，说明WIZ降解依赖Cullin-RING E3连接酶介导的UPS通路。为进一步验证9l是否促进CRBN与WIZ形成三元复合物，研究人员采用免疫共沉淀和NanoBiT互补发光实验进行分析。免疫共沉淀结果显示，在9l存在时CRBN与WIZ之间可检测到明显相互作用；NanoBiT实验进一步证明，这种相互作用在活细胞中呈浓度依赖性增强，9l的EC50为40.6?nM，Emax为3.9倍。上述证据共同支持9l作为典型分子胶，通过诱导CRBN–9l–WIZ三元复合物形成，驱动WIZ进入泛素化-蛋白酶体降解途径。

Induction of γ-globin expression upon WIZ degradation by 9l
鉴于WIZ是γ-珠蛋白表达的关键表观遗传调节因子，研究人员进一步在HUDEP-2红系细胞中检验9l的功能后果。实验显示，9l可在未分化HUDEP-2细胞中有效降解WIZ且不影响细胞活力。随后，在7天红系分化过程中，研究人员于每次换液时补加10?μM 9l，以维持持续WIZ抑制。RT-qPCR结果表明，9l处理可提高γ-珠蛋白mRNA水平，同时降低β-珠蛋白mRNA水平，提示其推动了血红蛋白表达谱向胎儿型转换。尽管9l诱导γ-珠蛋白的幅度低于已知化合物KMG-2937，但与DMSO对照相比仍具有统计学显著性。因此，该部分结果直接证明，靶向WIZ降解不仅在分子层面可实现，而且能够转化为与镰状细胞病治疗相关的功能输出。

综合讨论部分，本文建立了一条从筛选、化学优化、结构解析、机制验证到功能评估的完整研究链条。研究的核心贡献在于鉴定出一种不同于既往WIZ分子胶的新型CRBN基化学骨架，并通过系统SAR明确了五元杂芳酰胺，尤其是5-取代噻唑酰胺，在WIZ降解中的关键作用。通过对接分析和细胞机制实验，论文较为完整地证明了9l依赖CRBN、UPS和三元复合物形成而发挥作用。进一步在HUDEP-2模型中观察到γ-珠蛋白上调，则将化学降解与潜在治疗相关表型直接联系起来。整体而言，这项研究不仅为理解WIZ蛋白的可药性与分子胶识别机制提供了新的化学和生物学工具，也为开发诱导胎儿血红蛋白的小分子策略提供了新的结构基础。

研究结论部分可译为：研究人员开发出一类靶向转录因子WIZ的高效分子胶降解剂。该研究始于基于HiBiT的、针对CRBN化学文库的高通量筛选，由此发现了含有N-异噁唑-3-基酰胺基序的命中化合物6a。通过系统性的结构–活性关系研究，尤其是针对五元杂芳酰胺部分的优化，研究人员鉴定出降解活性更优的化合物9l。分子对接分析表明，9l通过与CRBN和WIZ形成关键氢键及π–π堆积相互作用，稳定三元复合物。生物学评价显示，9l是一种强效降解剂，其DC50为8.7?nM，Dmax为81.7%。动力学分析表明，9l处理可在3?h内迅速诱导WIZ降解，且该效应至少持续24?h。机制研究证实，9l诱导的降解依赖CRBN，并通过CRBN-9l-WIZ三元复合物介导的UPS发挥作用。重要的是，在HUDEP-2细胞中，9l介导的WIZ降解可诱导γ-珠蛋白表达，证实了靶向WIZ耗竭的功能性后果。总之，该研究确立了一类结构上有别于既有化合物的、基于CRBN的WIZ分子胶降解剂。这些化合物不仅可作为进一步研究WIZ蛋白生物学功能的有前景药理探针，也为新型降解剂的理性设计提供了新的结构基础。