利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝Ti–6Al–4V合金制备可重复使用温度响应性细胞培养表面（Reusable temperature-responsive cell-culture surfaces using poly(N-isopropylacrylamide)-grafted Ti–6Al–4V alloy）

《Results in Chemistry》：Reusable temperature-responsive cell-culture surfaces using poly(N-isopropylacrylamide)-grafted Ti–6Al–4V alloy

　　

细胞片工程日益依赖温度响应性细胞培养表面（Temperature-Responsive Cell-Culture Surface, TRCS）来获取完整细胞片，用于再生医学与组织工程。然而市售塑料基底TRCS为一次性使用，且高压蒸汽灭菌（autoclave）时易发生热变形，亟需开发可重复使用、耐热稳定的替代材料。本研究通过电子束（Electron Beam, EB）辐照法，借助甲基丙烯酰基硅烷偶联剂将聚(N-异丙基丙烯酰胺)（poly(N-isopropylacrylamide), PIPAAm）接枝于Ti–6Al–4V合金表面（记作PIPAAm-Ti），以构建可重复使用的TRCS。所得PIPAAm接枝层纳米级厚度随单体初始浓度变化，范围为7.6 ± 0.7 nm至22.9 ± 1.8 nm。PIPAAm-Ti表面因接枝PIPAAm链的温度依赖性水合/脱水作用而表现出温度响应性润湿性变化。各组中，采用50 wt%单体浓度制备的50PIPAAm-Ti具有最优聚合物层厚度（11.5 ± 1.1 nm），并在37 °C促进C2C12小鼠成肌细胞贴附、降温至20 °C实现完整细胞片自发脱附。细胞汇合后仅需降低培养温度即可从50PIPAAm-Ti上获得完整细胞片。将PIPAAm水溶液经多次高压蒸汽灭菌后检测其温度依赖透光率，证实PIPAAm链具有化学稳定性，经反复灭菌仍保留水合–脱水行为；50PIPAAm-Ti表面接枝层在反复灭菌后亦保持完整。与高温下变形的市售TRCS（UpCell?）不同，50PIPAAm-Ti在功能上无衰减，可支持至多三次"细胞培养—细胞片回收—高压蒸汽灭菌—再接种"循环。该可重复使用TRCS提供了一种环境友好型替代方案，可减少细胞培养应用中一次性塑料废弃物。

基于PIPAAm接枝Ti–6Al–4V合金的可重复使用温度响应性细胞培养表面研究解读

细胞片工程是再生医学和组织工程中的重要技术，可通过获取完整带有基底细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）及细胞间连接的细胞片用于心肌、骨骼肌、角膜及软骨等组织修复，也可拓展至培养肉和生物驱动器制造。其核心组件为温度响应性细胞培养表面（Temperature-Responsive Cell-Culture Surface, TRCS），通常是在聚苯乙烯组织培养皿（Tissue Culture Polystyrene, TCPS）上接枝聚(N-异丙基丙烯酰胺)（poly(N-isopropylacrylamide), PIPAAm），利用PIPAAm低于最低临界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature, LCST, ~32 °C）时水合亲水、高于LCST时脱水疏水的特性，在37 °C促进细胞贴附伸展，降温至20 °C左右使PIPAAm水合、破坏细胞–底物黏附，从而无酶收获完整细胞片。目前商业化TRCS产品（如UpCell?）为一次性塑料制品，且聚苯乙烯玻璃化转变温度低于标准高压蒸汽灭菌温度（121 °C, 0.2 MPa, 15–20 min），灭菌会发生不可逆热变形而无法重复使用。随着实验室塑料废物问题受到关注（估算占全球塑料废物约2%），开发可高压蒸汽灭菌、可多次重复使用的TRCS具有重要环境与实用价值。钛合金Ti–6Al–4V因其优良的生物相容性、机械强度和耐高温性（可耐受高压蒸汽灭菌不翘曲），被选作本研究基底材料。庆应义塾大学Junya Matsuzaki、Yoshikatsu Akiyama、Chikahiro Imashiro、Tatsuya Shimizu及Jun Komotori团队开展了此项研究，证明通过电子束辐照将PIPAAm接枝至经硅烷化处理的Ti–6Al–4V表面可制得功能完整的可重复使用TRCS，论文发表于《Results in Chemistry》。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：①Ti–6Al–4V合金圆盘经镜面抛光与氧等离子体活化后，用3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯气相沉积引入甲基丙烯酰基（methacryloyl）硅烷层（Silane-Ti）；②采用电子束（Electron Beam, EB, 0.25 MGy）辐照使不同浓度（10–70 wt%）N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropylacrylamide, IPAAm）单体在Silane-Ti表面接枝聚合形成PIPAAm-Ti；③利用X射线光电子能谱（X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS）和椭圆偏振仪表征表面元素组成与接枝层干态厚度；④利用座滴法测37 °C与20 °C水接触角验证温度响应性润湿性；⑤以C2C12小鼠成肌细胞为模型，评估不同PIPAAm-Ti表面的细胞贴附率（37 °C, 24 h）与降温后细胞脱附率（20 °C），并以镜面抛光Ti–6Al–4V（MP-Ti）和市售UpCell?作对照；⑥对优化组50PIPAAm-Ti进行多次高压蒸汽灭菌循环（121 °C, 20 min, 最多10次），通过XPS与PIPAAm溶液浊点（Cloud Point, CP）透光率曲线评价化学稳定性，并进行"灭菌–细胞培养至汇合–降温收获细胞片"的重复使用功能验证（最多3次循环）。

3.1. Surface characterization（表面表征）

研究人员通过XPS检测发现，氧等离子体处理去除了Ti–6Al–4V表面有机污染（C1s降至~1.1%），硅烷化引入C1s信号（升至10.7%），电子束辐照接枝PIPAAm后出现特征N1s峰（399.5 eV）及C1s羰基峰（287.9 eV），N/C原子比趋近PIPAAm理论值0.17，表明PIPAAm成功接枝；单体浓度越高Ti、Al、V基底信号越弱。椭圆偏振仪测得干态PIPAAm层厚度为：10PIPAAm-Ti 7.6 ± 0.7 nm、30PIPAAm-Ti 12.5 ± 1.1 nm、50PIPAAm-Ti 11.5 ± 1.1 nm、70PIPAAm-Ti 22.9 ± 1.8 nm。所有PIPAAm-Ti表面37 °C接触角~68–74°，降温至20 °C显著下降（p < 0.05），而Silane-Ti无温度变化，证实接枝PIPAAm链具温度依赖性水合/脱水转换。

3.2. Single-cell attachment and detachment assay（单细胞贴附与脱附实验）

以MP-Ti表面贴附细胞数为基准（100%），37 °C培养24 h后各表面细胞贴附效率为：10PIPAAm-Ti 124.4%、30PIPAAm-Ti 145.9%、50PIPAAm-Ti 211.6%、70PIPAAm-Ti 95.3%、UpCell? 108.7%，其中50PIPAAm-Ti促进细胞贴附效果最佳。降温至20 °C后，30PIPAAm-Ti、50PIPAAm-Ti和UpCell?的细胞脱附效率分别为96.4%、96.7%和98.4%；而10PIPAAm-Ti（过薄PIPAAm层无法充分水合）、70PIPAAm-Ti及MP-Ti（无温敏层）脱附效率为负值（细胞残留或轻微增殖），不能实现温敏脱附。据此选定50PIPAAm-Ti进行后续细胞片制备与重复使用研究。

3.3. Cell-sheet recovery（细胞片回收）

将C2C12细胞以1.5×10⁵cells/cm²种于50PIPAAm-Ti，37 °C培养48 h至汇合，降温至20 °C后30 min内细胞自发以连续细胞片形式脱附。Calcein AM/碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）双染并用Image J分析，回收细胞片中活细胞占比约90%，与文献报道UpCell?所获细胞片活力相当，证明PIPAAm-Ti表面可通过酶-free方式获取高活性完整细胞片。

3.4. Surface chemical stability during autoclave treatment（高压蒸汽灭菌下表面化学稳定性）

先考察1.0 wt% PIPAAm水溶液经1–10次高压蒸汽灭菌后的温度依赖透光率，各周期样品浊点均保持在~32.0–32.2 °C且无透射曲线偏移，说明游离PIPAAm链耐热降解。对50PIPAAm-Ti进行1–10次高压蒸汽灭菌后XPS检测，C1s羰基峰（287.9 eV）与N1s信号在AC0–AC5中稳定存在，C1s分峰拟合各组分比例接近理论值；至AC10时部分PIPAAm可能自表面微量脱落而非主链降解，总体表明接枝层与底层硅烷锚定键在≤5次高压蒸汽灭菌中化学稳定，纳米PIPAAm层可阻挡水汽对硅烷键的水解。

3.5. Cell-culture surface reusability（细胞培养表面可重复使用性）

50PIPAAm-Ti经"细胞培养→降温收获细胞片→乙醇/PBS清洗→密封袋高压蒸汽灭菌→干燥→再接种"流程，连续进行3次重复使用实验。每轮次中C2C12细胞均可正常贴附、增殖至汇合并在降温时完整脱附为细胞片，功能无明显衰减，证实该金属基TRCS可至少重复使用3个周期。

讨论与结论翻译

研究人员成功通过电子束辐照借助甲基丙烯酰基单元将PIPAAm接枝于Ti–6Al–4V合金表面。通过优化接枝PIPAAm层厚度（50PIPAAm-Ti），所得表面具备TRCS特征，可响应温度变化调控细胞贴附与脱附并实现细胞片制备。此外，接枝PIPAAm链在反复高压蒸汽灭菌下保持化学稳定及温度依赖性水合–脱水行为。市售TRCS（UpCell?）高压蒸汽灭菌会变形而无法再用，而50PIPAAm-Ti表面因聚合物层热稳定且基底无热变形，可作为TRCS重复使用至少三个循环。此类基于钛合金的可重复使用TRCS具有减少塑料废物与降低细胞片制造成本的显著优势，是细胞片工程领域中环境友好的替代平台，其广泛采用有望拓展细胞片工程的应用并促进该领域发展。