绿色合成银纳米粒子的抗菌活性、膜完整性和氧化应激评估：体外和分子对接研究

《ChemistryOpen》：Assessment of Antimicrobial Activity, Membrane Integrity, and Oxidative Stress of Green Synthesized Silver Nanoparticles: In Vitro and Molecular Docking Studies

　　

研究人员首次利用Acacia karroo叶的水提物合成银纳米粒子（AgNPs），其特征为紫外-可见（UV–Vis）吸收峰在424 nm处。通过透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察到球形形态，平均直径为33 nm。X射线衍射（XRD）分析验证了纳米粒子的晶体性质，在2θ值为38.19°、44.34°、46.21°、64.35°、77.54°和81.39°处有特征峰，对应面心立方银的(111)、(200)、(211)、(220)、(311)和(222)晶面。合成的AgNPs对所测菌株表现出中等抗白色念珠菌（Candida albicans）和抗菌活性。总体而言，经AgNPs处理的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）比未处理细胞表现出更高的细胞泄漏、蛋白质含量和丙二醛浓度。分子对接研究表明银与微生物蛋白之间存在强相互作用，其中与蛋白5NG5的结合亲和力最高，其次是5BNM和3HUM。

**研究背景与问题**
纳米材料因尺寸效应表现出独特性质，其中银纳米粒子（AgNPs）因强抗菌活性被广泛应用于食品包装、医疗和水处理等领域。传统化学合成方法依赖有毒试剂和苛刻条件，促使研究人员寻求绿色合成路线。植物提取物富含多酚、蛋白质等生物分子，可作为还原剂和稳定剂，实现环保合成。Acacia karroo（刺槐属）叶片富含缩合单宁和酚类物质，其水提物具有还原潜力。然而，AgNPs的抗菌机制尚未完全阐明，主要涉及活性氧（ROS）过量产生、银离子（Ag⁺）释放及与蛋白的结合。现有研究多聚焦于单一机制，缺乏对膜完整性、氧化应激及分子结合位点的系统关联分析。为此，本研究利用A. karroo叶绿素水提物绿色合成AgNPs，评估其抗菌活性，并通过体外实验和分子对接探讨其对细胞膜损伤和氧化应激的影响，揭示银原子与细菌关键蛋白的相互作用。

**研究内容与技术方法**
研究人员从阿尔及利亚Skikda采集A. karroo叶片，制备水提物，与1 mM硝酸银（AgNO₃）溶液按1:9（v/v）混合，在暗处搅拌合成AgNPs（称为Ak-AgNPs）。采用紫外-可见分光光度计（UV–Vis）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜-能量色散光谱（SEM-EDS）、透射电子显微镜（TEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对纳米粒子进行表征。抗菌活性通过琼脂孔扩散法和微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌/杀菌浓度（MBC/MFC），测试菌株包括大肠杆菌（E. coli）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、肠炎沙门氏菌（S. enteritidis）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）及临床分离的白色念珠菌（C. albicans）。膜完整性通过测定260 nm处核酸泄漏和Bradford法测蛋白泄漏，氧化应激通过硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量。分子对接使用Molegro Virtual Docker (MVD)软件，以中性银原子（Ag⁰）为配体，对接至大肠杆菌的AcrAB-TolC外排泵（PDB ID: 5NG5）和FabH（PDB ID: 5BNM）以及金黄色葡萄球菌的青霉素结合蛋白（PDB ID: 3HUM）的晶体结构。

**研究结果**
- **合成与表征**：混合10分钟后溶液变为红棕色，UV–Vis在424 nm处出现等离子体共振峰。XRD显示面心立方（FCC）结构，特征峰对应(111)、(200)、(211)、(220)、(311)、(222)晶面，晶粒尺寸约为21 nm（Scherrer公式）。SEM-EDS显示银强峰及少量碳、氧、氯，SEM和TEM确认球形形态，平均直径33 nm。FTIR揭示提取物中蛋白质和多糖的官能团参与还原和稳定，AgNPs形成后部分峰位移动或消失。
- **抗菌活性**：Ak-AgNPs对E. coli抑制圈最大（11.5 mm），对B. cereus最小（8.7 mm）；对C. albicans抑制圈8.2–12 mm。MIC值范围为250–1000 μg/mL（E. coli和P. aeruginosa为250 μg/mL，S. aureus和B. cereus等为500 μg/mL，C. albicans为1000 μg/mL）。革兰氏阴性菌更敏感，可能与其较薄的肽聚糖层有关。
- **膜完整性与氧化应激**：Ak-AgNPs处理E. coli和S. aureus后，细胞泄漏分别增加1.25倍和1.17倍，蛋白释放增加1.38倍和4.77倍，MDA水平升高2.2倍和2.0倍（均p<0.05）。这表明纳米粒子通过诱导脂质过氧化和膜通透性增加发挥抗菌作用。
- **分子对接**：重对接验证显示RMSD均<2.0 ?（5NG5为1.91 ?，5BNM为1.73 ?，3HUM为1.85 ?），确认对接参数可靠。Ag⁰与5NG5的结合能最强（?35.58 kcal/mol），主要与Glu238、Glu299、Glu298相互作用；与5BNM结合能为?29.00 kcal/mol，关键残基为His244和Glu302（距离2.52 ?和2.00 ?）；与3HUM结合能为?24.02 kcal/mol，主要通过Asp264和Thr265稳定。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Ak-AgNPs的抗菌活性虽中等，但其诱导的膜损伤和氧化应激效应显著，通过释放Ag⁺和产生ROS，破坏细菌细胞壁、抑制呼吸酶并干扰DNA合成。分子对接结果与体外实验一致，银原子与靶蛋白（如外排泵、脂肪酸合成酶、青霉素结合蛋白）的强结合力可能阻断关键生理功能，其中对AcrAB-TolC的亲和力最高，提示银能有效抑制多药外排。然而，研究仅限于体外和计算机模拟，需体内实验验证其生物相容性和毒性。结论部分原文：**“The aqueous leaf extract of A. karroo, acting as reducing and stabilizing agents, enabled the synthesis of spherical, crystalline silver nanoparticles with an average diameter of 33 nm. Despite moderate antimicrobial activity against tested bacteria and C. albicans, Ak-AgNPs exposure induced pronounced membrane damage in E. coli and S. aureus, evidenced by increased cell and protein leakage, as well as higher concentrations of malondialdehyde. Molecular docking indicates strong interactions of Ag with selected bacterial proteins, including the AcrAB?TolC complex and FabH in E. coli, alongside significant interactions with the penicillin-binding proteins of S. aureus. These results highlight the potential of silver nanomaterials as advantageous alternatives; however, it should be noted that the present findings are limited to in vitro and in silico approaches. Therefore, further studies are warranted to investigate interactions with additional bacterial target proteins, and further studies are required to comprehensively understand their antimicrobial mechanisms.”** 该研究发表于《ChemistryOpen》。