加载PERFECTA的脂质立方相液晶纳米粒用于19F磁共振成像：理化性质表征

《Chemistry – A European Journal》：PERFECTA Loaded Lipid Cubosomes for 19F-MRI: Physico-Chemical Characterization

　　

液晶纳米粒（LCNPs），例如立方相液晶纳米粒（cubosomes），因其独特的内部结构和生物相容性，在药物递送和生物成像领域展现出广阔的应用前景。在这项研究中，研究人员开发了基于植烷三醇（phytantriol）的立方相液晶纳米粒，采用普朗尼克F-127（Pluronic F-127）作为稳定剂，并负载PERFECTA（一种含有36个磁等价氟原子的氟化探针），用于构建¹⁹F磁共振成像（¹⁹F-MRI）纳米探针。PERFECTA负载的立方相液晶纳米粒通过溶剂蒸发法制备，并采用动态光散射（DLS）、小角度X射线散射（SAXS）、冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）、差示扫描量热法（DSC）、¹⁹F核磁共振（¹⁹F-NMR）及¹⁹F-MRI等技术进行表征。结果表明，PERFECTA负载的立方相液晶纳米粒保留了Pn3m立方相结构，在1–10 mg/mL的PERFECTA浓度范围内，包封效率均超过70%。Cryo-TEM观察显示PERFECTA在立方相液晶纳米粒内 segregate 形成球形结构域，这些结构域或嵌入立方相液晶纳米粒内部，或以独立纳米粒形式存在。SAXS和DSC分析提示部分PERFECTA整合进入植烷三醇双分子层，影响了内部液晶有序结构。PERFECTA负载的立方相液晶纳米粒在生物相关介质中表现出优异的胶体稳定性，在含胎牛血清的细胞培养基中24小时内维持结构完整性和氟含量不变。得益于其优良的弛豫特性（T₁ = 497 ± 50 ms，T₂ = 281 ± 4 ms）和稳健的¹⁹F-MRI信号，这些立方相液晶纳米粒作为稳定、高效的纳米诊疗平台，在生物医学成像和药物递送领域具有重要应用潜力。

脂质自组装纳米系统因其固有的生物相容性和简便的合成方法，在药物递送领域占据重要地位，其中美国食品药品监督管理局（FDA）批准的大多数纳米制剂均以脂质为关键组分。在COVID-19大流行期间，基于脂质的纳米制剂（LNPs）成功应用于信使核糖核酸（mRNA）疫苗的递送，进一步凸显了该类平台的重要性。在众多脂质纳米系统中，液晶纳米粒（LCNPs）作为新兴的药物/基因递送载体受到广泛关注。立方相液晶纳米粒（cubosomes）由高度弯曲的脂质双分子层自组装形成复杂的立方晶格三维结构，具有膜表面积与体积比高（400 m²/g）、可负载亲水性和疏水性分子以及独特的膜融合特性等优势。传统上，立方相液晶纳米粒主要负载荧光染料或氮氧自由基脂质用于成像，而本研究则致力于开发能够负载¹⁹F-MRI探针PERFECTA的纳米系统，以实现内在的成像功能。磁共振成像（MRI）因其非侵入性、无电离辐射及优异的组织穿透能力而成为强大的分析工具，¹⁹F-MRI更因氟原子在体内几乎无背景信号而能够实现明确的定位检测。PERFECTA含有36个磁等价的¹⁹F核，可实现信号强度的线性放大，是理想的高灵敏度探针选择。该论文发表于《Chemistry – A European Journal》。

研究采用的关键技术方法主要包括：溶剂蒸发法制备PERFECTA负载的植烷三醇/普朗尼克F-127立方相液晶纳米粒；动态光散射（DLS）测定水动力粒径和多分散指数；小角度X射线散射（SAXS）表征内部液晶结构及相变行为；冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）观察纳米粒形态及PERFECTA分布；差示扫描量热法（DSC）分析热致相变温度变化；¹⁹F-NMR定量测定包封效率及弛豫时间（T₁和T₂）；以及7 T磁共振扫描仪进行¹⁹F-MRI成像验证信号强度与浓度关系。

PERFECTA负载立方相液晶纳米粒的制备与基础表征

研究人员采用溶剂蒸发法，将植烷三醇与不同浓度的PERFECTA溶于乙酸乙酯，经涡旋、超声处理后，滴加至含普朗尼克F-127的水相中，再通过超声乳化并蒸发除去有机溶剂，成功制备了PERFECTA负载的立方相液晶纳米粒。DLS结果表明，纳米粒的水动力粒径约200 nm，多分散指数（PDI）约为0.11–0.15，PERFECTA的存在未显著影响粒径分布。通过定量¹⁹F-NMR测定，各浓度组分的包封效率（EE%）均高于70%，即使在高浓度（10 mg/mL）时仍有73%的包封效率，且制剂在室温下可稳定储存两周以上。

PERFECTA负载立方相液晶纳米粒的内部结构与相行为

SAXS分析证实，PERFECTA负载后立方相液晶纳米粒仍保留Pn3m立方相结构，晶格参数基本保持不变。然而，在低散射矢量（q）区域观察到随PERFECTA浓度增加的幂律散射增强，提示体系中可能存在F-127稳定的PERFECTA纳米粒。为验证这一假设，研究人员制备了不含植烷三醇的F-127-PERFECTA纳米粒作为对照，发现其在低q区域与PERFECTA负载立方相液晶纳米粒的散射曲线重叠，且缺乏液晶有序特征衍射峰。¹⁹F-NMR显示两组分的化学位移几乎一致（约?72.4 ppm），表明PERFECTA在两种体系中所处化学环境相似。

Cryo-TEM进一步揭示了PERFECTA在立方相液晶纳米粒中的分布特征：PERFECTA优先segregate形成球形结构域，或嵌入立方相液晶纳米粒内部，或形成独立的纳米粒，部分独立纳米粒外围似有包被层。这些球形结构域直径约100 nm。相比之下，F-127-PERFECTA纳米粒虽形态相似，但尺寸更大、多分散性更高且缺乏外围包被层。

为阐明立方相液晶纳米粒中嵌入氟化球形结构域的形成机制，研究人员对制备过程的不同阶段进行了DLS和SAXS分析。结果显示，超声后立即形成的无定形纳米粒约255 nm，蒸发乙酸乙酯后才出现特征性的Pn3m立方液晶晶格。温度对比实验表明，70°C超声对于实现PERFECTA与植烷三醇的均匀混合至关重要；较低温度超声会导致可见沉淀、粒径减小及包封效率降低，且Cryo-TEM显示缺乏球形PERFECTA结构域的大型立方纳米粒。延长70°C超声时间可减少非结构化纳米粒数量。

基于上述观察，研究人员提出两种可能的机制：一是PERFECTA迅速segregate形成由聚合物和/或脂质包被的球形结构域以最小化与水的接触，随后与植烷三醇立方相融合；二是PERFECTA在高温超声过程中与植烷三醇初始混合，溶剂蒸发形成液晶相时驱动过量PERFECTA segegate至表面结构域。为区分这两种机制，研究人员通过温度依赖的SAXS和DSC实验研究了PERFECTA在脂质双分子层中的整合情况。

温度扫描SAXS实验显示，空立方相液晶纳米粒及1 mg/mL PERFECTA负载样品在所有研究温度下均保持内部结晶结构，而高浓度PERFECTA样品（5和10 mg/mL）在70°C时丧失长程有序，发生向无序相的转变。这一浓度依赖效应支持PERFECTA部分整合进入脂质双分子层、扰乱内部液晶有序性的假说。值得注意的是，PERFECTA负载样品中未观察到典型L₂无序相的宽峰，提示体系可能形成植烷三醇-PERFECTA纳米粒并排出水分。

DSC分析进一步量化了相变温度与PERFECTA负载的关系。空立方相液晶纳米粒在25°C处出现普朗尼克F-127的温度诱导缔合峰，在61.7°C处出现立方相液晶纳米粒的有序-无序转变峰。PERFECTA负载样品则显示约57°C、60°C和65.6°C三个转变事件，其中65.6°C峰与PERFECTA本身的热事件一致，证实部分探针整合于双分子层内。57°C和60°C两个峰相对于纯立方相液晶纳米粒的61.7°C均向低温移动，且峰的分裂暗示PERFECTA在双分子层中呈非均匀分布，PERFECTA富集区域因脂质堆积和曲率应力的局部扰动而在较低温度转变，而PERFECTA贫乏区域则更接近原始植烷三醇立方相液晶纳米粒的转变温度。综合SAXS和DSC结果，研究人员认为PERFECTA在高温制备过程中插入脂质双分子层的机制更为可靠，但尚需进一步研究以明确PERFECTA在膜中的空间组织。

PERFECTA负载立方相液晶纳米粒的生物学稳定性与MRI性能

鉴于立方相液晶纳米粒在50°C以下可维持立方相结构，研究人员评估了其在生物相关介质中的稳定性。将含5 mg/mL PERFECTA的立方相液晶纳米粒置于37°C、含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中孵育24小时，模拟体外细胞培养条件。DLS显示纳米粒在24小时内仍可检测，水动力粒径基本不变。SAXS证实3和12小时后立方液晶相特征衍射峰保留，24小时后散射图谱噪音增大，长程立方有序的持续性尚难定论。¹⁹F-NMR分析表明，孵育24小时后PERFECTA特征峰（?72.4 ppm）相对于三氟乙酸（TFA）参考峰（?75.5 ppm）保持不变，氟含量保留相当于初始PERFECTA质量的85.5%。这些结果为该体系在生物相关条件下的稳定性提供了有力支持。

弛豫特性测定显示，PERFECTA负载立方相液晶纳米粒的纵向弛豫时间（T₁）为497 ± 50 ms，横向弛豫时间（T₂）为281 ± 4 ms，与已报道的其他PERFECTA基制剂（如卵磷脂乳剂和聚合物稳定纳米粒）相当。这些弛豫参数表明该体系具有适合¹⁹F-MRI的优良特性，可采用快速成像序列。体模研究进一步证实，PERFECTA浓度≥1.6 mg/mL时¹⁹F-MRI信号强度即高于检测阈值，且信号强度随浓度增加而增强。

结论部分，研究人员指出该工作成功开发了PERFECTA负载的液晶纳米粒作为¹⁹F-MRI纳米探针。以植烷三醇为脂质基质、普朗尼克F-127为空间稳定剂，制备了具有Pn3m对称性内部液晶有序结构的稳定、单分散立方相液晶纳米粒。该纳米粒对PERFECTA的包封效率超过70%，终浓度范围为1–10 mg/mL。DLS和SAXS分析证实了液晶纳米粒在水相和生物介质中的稳定性，¹⁹F-NMR实现了封装氟原子的定量。Cryo-TEM揭示部分PERFECTA倾向于segregate形成位于立方相液晶纳米粒表面的球形结构域，多数情况下嵌入液晶纳米粒内部，这可能与稳定剂聚合物的存在有关。SAXS测量突出了PERFECTA对内部液晶有序性的浓度依赖性温度效应：70°C时，5和10 mg/mL PERFECTA负载的立方相液晶纳米粒发生向无序相的转变，而空立方相液晶纳米粒或1 mg/mL负载样品则不然。这些发现表明部分PERFECTA也整合进入植烷三醇脂质双分子层，尽管其含量尚不足以显著改变结构参数。微DSC分析进一步支持了这一解释，显示PERFECTA的存在降低了有序-无序转变发生的温度。总体而言，这些结果从基础和应用角度为氟化化合物与脂质液晶相之间的相互作用提供了宝贵见解。立方相液晶纳米粒内部的水通道为共封装亲水性 cargo（如核酸）提供了可能，结合PERFECTA的高效整合，该平台有望作为有前景的纳米诊疗系统用于未来的生物医学应用。