TEAD1凝聚体定位于癌细胞近着丝粒异染色质且不具转录活性

《Nature Cell Biology》：TEAD1 condensates are transcriptionally inactive storage sites on the pericentromeric heterochromatin in cancer cells

　　

转录增强因子TEAD结构域转录因子1（TEA domain transcription factor 1, TEAD1）是Hippo信号通路（Hippo pathway）中调节细胞稳态与发育的重要转录因子，其在肿瘤生物学中的作用日益受到关注。本研究揭示了TEAD1在组织核内凝聚体方面的一个非预期功能，该功能与其活性转录无关。研究人员利用高分辨率成像、染色质免疫共沉淀测序（ChIP–seq）、RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）及邻近标记蛋白质组学等技术，证实患者来源的肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）细胞中，TEAD1通过其DNA结合结构域与异染色质的近着丝粒区域结合，形成微米级凝聚体。TEAD1特异性的MCAT基序在近着丝粒区域选择性富集并聚集，从而特异性地作为TEAD1凝聚体的成核位点。这些TEAD1凝聚体并不激活转录，而是作为过量TEAD1的储存库；破坏TEAD1凝聚体可导致YAP（Yes-associated protein）及TEAD靶基因表达上调。这种TEAD1的组织方式与RCC及正常肾细胞其他基因组区域中观察到的TEAD1分布形成鲜明对比——在这些区域中，TEAD1与活性转录标记物共定位。上述发现为TEAD1的双重调控角色提供了机制框架，并为其在转录失调和肿瘤进展中的贡献提供了新见解。

研究背景与问题提出

生物分子凝聚体是细胞内由蛋白与核酸通过弱相互作用形成的动态组装体，在转录、RNA剪接和DNA修复等关键细胞过程中发挥重要作用。转录相关因子形成的转录凝聚体虽受到日益广泛的关注，但其形成机制与功能仍有待阐明。液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）是解释凝聚体组装的主导模型，但低价位与空间聚集的DNA结合位点相互作用等替代机制亦被提出。值得注意的是，尽管转录凝聚体通常被认为促进基因表达，部分研究亦显示其具有转录抑制功能。因此，深入理解转录凝聚体在生物相关背景下的形成机制与功能，对于开发针对神经退行性疾病和癌症等疾病的靶向策略至关重要。RCC作为常见肾脏恶性肿瘤，尽管无病生存率已有显著提升，但转移性疾病的有效管理仍是临床面临的重大挑战，且RCC进展的分子机制尚待明确。Hippo信号通路是调控细胞生长的保守信号网络，在RCC中频繁发生遗传改变。该通路的核心功能是通过磷酸化使下游转录共激活因子YAP及其旁系同源物TAZ（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif）滞留于细胞质从而实现抑制；当Hippo通路"关闭"或突变时，YAP和TAZ转位至核内，与TEAD1–TEAD4结合并激活促进细胞增殖与存活的基因。然而，Hippo通路组分在细胞内激活的具体时空位置与方式并不清楚。近年来，Hippo通路多个组分被发现可形成生物分子凝聚体，其中YAP和TAZ首先被发现可形成激活转录的凝聚体；随后上游激酶和接头蛋白的凝聚体形成及其对信号转导的影响也被报道。尽管TEAD1–TEAD4通常被认为是被招募至YAP和TAZ凝聚体中的客户蛋白，但有研究表明TEAD凝聚体在YAP或TAZ过表达后可转化为活性枢纽，而过表达系统的局限性限制了对TEAD凝聚体生理功能的理解，且Hippo通路组分凝聚体在各类癌症中的功能尚不清楚。

研究目标与核心结论

本研究聚焦于Hippo突变型RCC中由TEAD1形成的转录凝聚体。研究人员发现，与大多数转录凝聚体不同，TEAD1凝聚体定位于异染色质的近着丝粒区域，且不介导活性转录。综合ChIP–seq、RNA-seq和蛋白质组学数据表明，TEAD1凝聚体可能是缓冲过量TEAD1的储存位点，尤其在Hippo突变的肾癌细胞中。这些发现揭示了转录凝聚体的一种有趣替代功能，以及细胞利用凝聚体维持稳态和应对疾病的新方式。该研究成果发表于《Nature Cell Biology》，为理解TEAD1的双重调控角色提供了机制框架，并为肿瘤治疗策略的开发提供了新思路。

主要技术方法

研究采用患者来源的RCC细胞系（UOK121、UOK122、UOK342等）及非癌性肾小管上皮细胞系HK2作为对照；运用免疫荧光结合Airyscan高分辨率显微成像、荧光恢复 after 光漂白（FRAP）、单颗粒追踪（SPT）及活细胞成像进行凝聚体表征；通过ChIP–seq分析TEAD1、YAP、H3K27ac和H3K9me3的基因组分布；采用RNA-seq进行基因表达分析；利用邻近标记质谱技术（miniTurbo-HaloTag系统）鉴定TEAD1凝聚体的蛋白质组分；通过体外重组蛋白与不同MCAT基序DNA共孵育研究相分离行为；使用高渗蔗糖或NaCl处理及超微质谱分析等探究凝聚体功能。

研究结果

TEAD1在癌细胞中形成大型凝聚体

研究人员首先检测了多种患者来源RCC细胞系中YAP和TEAD1的表达水平，发现UOK121和UOK342细胞同时高表达YAP和TEAD1。与YAP在核内弥漫开发者形成小凝聚体不同，TEAD1仅在UOK121和UOK342细胞中形成显著的微米级凝聚体（称为大型TEAD1凝聚体，large TEAD1 condensates, LTCs），多数细胞含1至5个LTCs，且多定位于近核膜或核仁区域。TEAD1敲低可消除凝聚体形成，且凝聚体未被淀粉样染料标记，证实其非蛋白聚集物。黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌和骨肉瘤等多种癌细胞系中亦观察到TEAD1凝聚体，而相应非癌性细胞中未见此现象。TEAD家族成员中，TEAD2和TEAD3不形成凝聚体，TEAD4虽可形成但较弱。值得指出的是，此前研究发现TEAD1自身不能形成凝聚体而是被招募至YAP凝聚体中，但本研究中TEAD1形成的LTCs不富集内源性YAP，这促使研究人员进一步探究其形成机制与功能。

LTCs不介导活性转录

为探究TEAD1凝聚体是否介导活性转录，研究人员检测了其与RNA聚合酶II磷酸化丝氨酸2（RNA PolII-pSer2，转录延伸标志物）、H3K27ac（活性增强子标志物）及BRD4（超增强子相关转录共激活因子）的共定位关系。结果显示，TEAD1凝聚体不与上述任何活性转录标记物共定位，反而将其排除在外。EU掺入的新生RNA标记实验亦显示LTCs无活性转录，与作为活跃核糖体RNA转录中心的核仁形成对比。同时，LTCs也不与YAP–TEAD经典靶基因CYR61的新生mRNA共定位。此外，LTCs不与Cajal体、核斑或PML核体等已知核内无膜细胞器共定位，表明其为一种独特的含转录因子但不介导活性转录的凝聚体。有趣的是，TEAD1除形成LTCs外还形成大量小型TEAD1凝聚体（small TEAD1 condensates, STCs），后者与YAP共定位并介导活性转录（与CYR61新生mRNA共定位），与LTCs在大小和功能上形成鲜明对比。

TEAD1凝聚体定位于近着丝粒异染色质区域

鉴于LTCs不与活性转录标记物关联且靠近核膜和核仁（异染色质富集区域），研究人员检测了其与异染色质标记物H3K9me3的共定位，发现LTCs在凝聚体阳性肾癌细胞及其他癌细胞系中与H3K9me3结构域共定位，而凝聚体阴性细胞中未见此现象。LTCs还与异染色质组装蛋白HP1α共定位，但不与Polycomb体标记物共定位，表明其定位于独特的异染色质区域。进一步分析显示，LTCs紧邻着丝粒，与着丝粒标记物CENP-A的距离显著近于端粒标记物TRF2，证实TEAD1凝聚体特异性定位于近着丝粒异染色质区域。

TEAD1 DNA结合结构域对凝聚体形成至关重要

为验证LTCs是否由DNA结合驱动形成，研究人员构建了DNA结合结构域缺失或位点特异性突变（F43P/L47P的H1Mut和Q89P/S92P的H3Mut）的TEAD1变异体。结果显示，DNA结合受损的变异体均形成较少凝聚体且不定位至异染色质，而氨基末端固有无序区（IDR）缺失、YAP结合位点突变为Y406H或蛋白激酶A磷酸化位点S102突变均不影响LTCs形成及其与异染色质的关联，表明DNA结合结构域对TEAD1凝聚体在近着丝粒异染色质上的形成至关重要。

TEAD1与YAP共占据远端增强子位点激活基因表达

研究人员在凝聚体阳性（UOK121、UOK342）和阴性（UOK122、HK2）细胞系中进行了RNA-seq和ChIP–seq分析。结果显示，所有细胞系中大多数TEAD1–YAP共占据峰位于远端基因间区或内含子区域，与H3K27ac峰呈双峰分布，符合TEAD1–YAP在远端增强子位点共占据以激活基因表达的特征。MEME–ChIP分析证实TEAD家族特异性MCAT基序为最富集的结合基序。

TEAD1凝聚体由近着丝粒异染色质的Clustered MCAT基序所"播种"

研究人员发现近着丝粒区域存在MCAT基序的显著富集和高度聚集，而长度匹配的AP-1基序无此现象，表明该模式对TEAD1结合位点具有特异性。ChIP–seq进一步显示25–35%的TEAD1结合位点与H3K9me3区域相交，且这些共结合区域与MCAT富集的近着丝粒区域重合，表明TEAD1与近着丝粒异染色质中聚集的MCAT基序结合驱动凝聚体形成。体外重组TEAD1蛋白实验显示，含4个串联MCAT重复的DNA使TEAD1形成最多凝聚体（较0×MCAT高3.4倍，较1×MCAT高13.7倍），而单一MCAT反而减少凝聚体形成。这一溶解度变化支持如下模型：弱或无DNA结合时TEAD1主要通过自身弱相互作用驱动凝聚；高亲和力DNA结合时，多价相互作用（蛋白-蛋白及蛋白-DNA）和TEAD1有效局部浓度增加协同驱动相分离超越TEAD1固有能力，为近着丝粒区域LTCs形成提供了生物物理学依据。

TEAD1凝聚体作为缓冲过量TEAD1的储存库

差异表达分析显示，TEAD1–H3K9me3共结合位点距离最近转录起始位点超过500 kb，且邻近基因未显著上调或下调。在TEAD1表达水平相似的细胞中，LTCs数量（0–3个）不影响CYR61表达，结合LTCs与活性转录标记物和转录位点的空间分离，表明近着丝粒TEAD1凝聚体不太可能直接驱动转录，而更可能作为核内TEAD1储存库。单颗粒追踪实验显示TEAD1在LTCs中解离更慢、停留时间更长，表明LTCs"捕获"TEAD1蛋白。为明确LTCs的储存库功能，研究人员采用高渗应激（山梨醇或NaCl）而非低渗应激快速解离LTCs，发现凝聚体阳性细胞中LTC解离伴随TEAD靶基因表达增加，而凝聚体阴性细胞无此效应，证实LTCs通过"播种"于近着丝粒区域来缓冲下游基因表达。

TEAD1凝聚体选择性整合蛋白质组分

通过miniTurbo邻近标记质谱技术，研究人员在UOK342细胞中鉴定了186个在野生型TEAD1凝聚体中特异性富集的蛋白。基因本体分析显示这些蛋白与DNA结合和转录调控相关。共免疫荧光证实复制蛋白A2（RPA2）与TEAD1凝聚体共定位，但RPA2敲低不影响凝聚体形成或大小，FRAP显示RPA2荧光恢复远快于TEAD1，表明RPA2可能是选择性分配入TEAD1凝聚体的客户蛋白。这些发现提示TEAD1凝聚体除储存TEAD1外，还可能选择性整合蛋白质以维持染色质结构。

讨论与结论

本研究的重要发现是TEAD1形成两种在大小和功能上截然不同的凝聚体：小型、转录活跃并与YAP共定位的经典凝聚体；以及大型、转录沉默并定位于异染色质、作为过量TEAD1储存库的凝聚体。细胞需要维持最佳蛋白浓度以利于稳态——蛋白过少可能延迟有丝分裂进入，过多则可能促进蛋白聚集和/或下游信号过度激活。研究人员提出，TEAD1蛋白凝聚是调节TEAD1浓度的另一种方式，用于缓冲和限制过量TEAD1可能造成的损害效应，从而为RCC细胞提供生存优势。在RCC细胞中，YAP–TAZ和TEAD1可激活介导铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性细胞死亡途径）的基因，而形成无活性的TEAD1凝聚体可能是保护癌细胞免于铁死亡的一种未知方式。当然，TEAD1凝聚体也可能代表这些细胞减少YAP–TEAD介导的细胞增殖、从而防止肿瘤发生的徒劳尝试。

值得注意的是，LTCs并非随机定位于核内，而是特异性定位于近着丝粒异染色质区域。这些区域长期被认为是转录不活跃结构域，但对维持着丝粒完整性和有丝分裂过程中染色体正确分离至关重要。尽管大多数转录因子不存在于这些区域，少数因子如热休克转录因子1（HSF1）和GAGA因子等可在特定条件下定位于此。Ikaros蛋白也在淋巴细胞着丝粒异染色质形成凝聚体并抑制邻近基因。本研究提出了近着丝粒区域的新功能：作为依赖DNA结合的过量TEAD1储备库。过表达实验表明，在TEAD1凝聚体阴性细胞系中过表达TEAD1，可在异染色质（可能为近着丝粒区域）形成TEAD1凝聚体，提示这是细胞储存TEAD1的通用机制，也引发了对其他转录因子能否特异性定位于近着丝粒或其他异染色质区域并形成凝聚体的问题。

针对凝聚体的靶向治疗已成为治疗神经退行性疾病和癌症等既往难以治疗疾病的 promising 策略。本研究数据表明，并非疾病中观察到的所有凝聚体都驱动该疾病；而且单一转录因子在不同细胞类型中也可形成不同大小和功能的凝聚体。因此，仔细研究凝聚体的形态和功能对于设计精确的凝聚体靶向治疗至关重要。

研究结论部分翻译：

在该研究中，研究人员做出了一个有趣的发现：TEAD1形成两种在大小和功能上均不同的凝聚体：（1）小型的、转录活跃的TEAD1凝聚体，即与YAP共定位的经典凝聚体；（2）巨型的、转录沉默的TEAD1凝聚体，定位于异染色质并作为储存库，在相对无害的基因组位置储存过量TEAD1蛋白。细胞需要维持最佳蛋白浓度以保证稳态；蛋白过少可能延迟进入有丝分裂，而过多可能促进蛋白质聚集和/或下游信号通路的过度激活。此外，非转化细胞中的致癌基因异常激活常引发涉及细胞周期停滞的癌基因诱导衰老。多种细胞过程参与蛋白质稳态调控，包括转录、翻译和蛋白质降解系统的调节。研究人员提出，TEAD1的蛋白质凝聚代表调节TEAD1浓度的另一种方式，用于缓冲和限制过量TEAD1可能造成的损害效应，这可能赋予RCC细胞生存优势。在RCC细胞中，YAP–TAZ和TEAD1可激活介导铁死亡的基因；通过形成无活性的TEAD1凝聚体来防止TEAD1过度活性，可能代表保护癌细胞免于铁死亡的一种先前未知的方式。然而，并非所有癌细胞中的现象都促进癌症——TEAD1凝聚体也可能代表这些细胞减少YAP–TEAD介导的细胞增殖、从而防止肿瘤发生的徒劳尝试。尽管研究人员已成功使用高渗应激破坏TEAD1凝聚体，未来研究将探究TEAD1凝聚体的生理调控机制，以明确其在细胞适应性和癌症进展中的作用。