柱切换-高效液相色谱法（Column-Switching High-Performance Liquid Chromatography，Column-Switching HPLC）同时测定六种维生素K（植物甲萘醌 Phylloquinone PK/维生素K1、甲基萘醌-4 Menaquinone-4 MK-4、MK-6、MK-7、MK-8、MK-9 及长链甲基萘醌 Long-Chain Menaquinones）的分析方法改进及其在各类奶酪与发酵豆制品中维生素K含量分析中的应用

《Food Analytical Methods》：Improvement of an Analytical Method for Six Types of Vitamin K, Including Long-Chain Menaquinones, via Column-Switching High-Performance Liquid Chromatography and Analysis of the Vitamin K Contents of Various Cheeses and Fermented Soybean Products

　　

本研究改进了一种带柱切换（Column-Switching）的高效液相色谱-荧光检测（High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection，HPLC-FLD）方法，以实现对主要维生素K类型——包括植物甲萘醌（Phylloquinone，PK；即维生素K1）、甲基萘醌-4（Menaquinone-4，MK-4）、MK-7，以及长链甲基萘醌（Long-Chain Menaquinones）如MK-6、MK-8和MK-9——的同时分析。六种维生素K在50 min运行时间内被高灵敏度检出。此外，研究人员评估了该方法的精密度与专属性：保留时间（Retention Time，tR）与峰面积的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分别小于0.3%和3.00%；不同维生素K类型的检出限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantification，LOQ）分别为0.17–0.60 ng/mL和0.42–1.71 ng/mL。研究人员使用改进后的方法分析了多种奶酪和发酵豆制品。奶酪中几乎全部检出了PK、MK-4、MK-8和MK-9，其中MK-8和MK-9占优势且呈高度正相关（r = 0.97），MK-9水平约为MK-8的2.5倍。发酵豆制品中，纳豆（Natto）、豆豉（Douchi）和韩国大酱（Doenjang）总维生素K含量较高，分别为406.71 ± 6.83、100.30 ± 0.80和307.95 μg PK当量（PKeq）/100 g；这些样品除含有高水平MK-7外还含有较高水平的MK-8。本研究首次对日本纳豆及多种亚洲发酵豆制品中的长链维生素K组成进行了全面比较。

研究背景与意义

维生素K为一类脂溶性营养素，天然存在形式为植物甲萘醌（Phylloquinone，PK；维生素K₁）和甲基萘醌（Menaquinone，MK；维生素K₂），MK按异戊二烯侧链数目（n=4–14）分为MK-n。PK主要存在于绿叶蔬菜和海藻中，MK-4来自动物源性食品，MK-7主要源自纳豆（Natto，日本发酵大豆制品）中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的发酵产物。维生素K参与凝血、骨骼健康维护及动脉粥样硬化预防等生理过程。现有高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）结合柱后还原荧光检测可分析PK、MK-4和MK-7，但对食品中微量长链MK（MK-6、MK-8、MK-9）灵敏度不足；已有柱切换HPLC法仅针对PK、MK-4、MK-7，未涵盖长链MK；液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）成本高昂限制普及。因此，有必要建立一种经济、灵敏、可同时测定六种维生素K（PK、MK-4、MK-6、MK-7、MK-8、MK-9）的改进柱切换HPLC-荧光检测方法，并应用于奶酪与亚洲发酵豆制品中维生素K组成的系统比较。该论文发表于《Food Analytical Methods》。

主要关键技术方法

研究人员以CAPCELL PAK C₁₈MG预柱（75 mm × 4.6 mm，5 μm）和分析柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）及铂还原柱（Platinum Reduction Column，RC-10，4.0 × 15 mm）组建双泵柱切换HPLC系统，流动相为甲醇:2-丙醇（60:40，v/v），流速0.5 mL/min，荧光检测器激发波长240 nm/发射波长430 nm。将分析柱由15 cm延长至25 cm并优化柱切换时间（0–3 min位A冲洗预柱，3–14 min位B使分析物转入分析柱，14–50 min回位A洗脱杂质）。方法验证包括精密度（日内/日间RSD）、专属性（t_R、容量因子K′、分离度R_s、选择性因子α）、线性（加权1/x²回归）、LOD（S/N=3）、LOQ（S/N=10）及加标回收率（奶酪布谢特蜜尔Buchette Miel与豆瓣酱Doubanjiang中添加0–100 ng/mL混合标准品）。样本队列来源：市售17种奶酪（蓝霉、白霉、新鲜、半硬、硬质奶酪及牛/羊奶原料）与15种发酵豆制品（日本味噌Miso、纳豆Natto、冲绳豆腐乳、中国豆豉Douchi/豆瓣酱Doubanjiang/甜面酱/臭豆腐、韩国大酱Doenjang/辣椒酱Gochujang等及原料大豆），按日本食品成分分析手册2015版提取维生素K（奶酪用75%丙酮-正己烷，豆制品用70%乙醇-正己烷），离心浓缩后分别以2-丙醇:环己烷=9:1（v/v）或纯2-丙醇复溶进样，所有操作避光。结果以叶醌当量（Phylloquinone Equivalent，PKeq，μg PKeq/100 g）表示，并做主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）。

研究结果

Method Validation（方法验证）

通过将激发波长由320 nm改为240 nm并结合25 cm分析柱与优化柱切换时间，六种维生素K标准品（MK-4、PK、MK-6、MK-7、MK-8、MK-9）在15.31、19.56、22.47、28.06、35.64、45.94 min依次洗脱，50 min内完成高灵敏度检测。t_R的RSD < 0.3%，峰面积RSD < 3.00%；日内/日间t_RRSD < 0.59%，峰面积RSD < 6.52%；各VK的校准曲线相关系数r > 0.996。LOD为0.17–0.60 ng/mL，LOQ为0.42–1.71 ng/mL。加标回收实验：奶酪基质中低浓度（2、10 ng/mL）回收率82.48%–103.27%，高浓度长链MK因强亲脂性与脂肪基质结合回收略低；豆瓣酱基质中各浓度回收率82.24%–103.27%。结论：改进方法特异性、精密度、线性、灵敏度及回收率均满足食品基质中六种VK定量分析要求。

Vitamin K Contents in Various Types of Cheeses（各类奶酪中维生素K含量）

牛/羊奶仅含PK和MK-4。大多数奶酪含PK、MK-4、MK-8、MK-9，其中戈尔贡佐拉Gorgonzola、马苏里拉Mozzarella和帕玛森Parmesan未检出长链MK（因使用嗜热链球菌Streptococcus thermophilus等不产长链MK的菌种）。奥弗涅蓝纹奶酪（Fourme d'Ambert、Tome de Laqueuille、Bleu d'Auvergne）含显著MK-7（最高Tome de Laqueuille总VK 28.78 ± 0.47 μg PKeq/100 g），MK-8和MK-9在荷兰高达Holland Mimolette等硬质/半硬质奶酪中占优。MK-8与MK-9呈强正相关（r = 0.97），MK-9含量约为MK-8的2.5倍。PCA显示PC1（53.4%）和PC2（28.9%）区分了以PK/MK-4为主的鲜软奶酪、以MK-8/MK-9/MK-4为主的陈化硬质奶酪及富含MK-7的蓝纹奶酪。结论：奶酪中VK谱取决于发酵微生物种类与工艺，该方法可有效区分。

Vitamin K Contents in Different Fermented Soybean Products（不同发酵豆制品中维生素K含量）

原料大豆仅含PK，无MK-4/MK-9（低于LOQ）。日本味噌（大麦/米味噌）仅含PK（Aspergillus oryzae及耐盐酵母不产生长链MK）。纳豆Natto含大量MK-7（374.23 ± 6.26 μg PKeq/100 g）及MK-6、MK-8、PK（Bacillus subtilis natto合成MK-7）。日本咸纳豆Hamanatto含MK-8、MK-9（Lactococcus spp.合成）但无MK-7。中国豆豉Douchi含MK-7（76.94 ± 0.56 μg PKeq/100 g）、MK-6、MK-8、MK-9及少量PK（Bacillus sonorensis等早期产MK-7，Lactococcus后期产MK-8）；豆瓣酱、甜面酱含微量长链MK；红/臭豆腐含少量长链MK（白腐乳未检出）。韩国大酱Doenjang含MK-7（268.48 ± 6.41 μg PKeq/100 g）、MK-6、MK-8及PK（初期B. subtilis产MK-7，后期乳酸菌相关阶段产MK-6/MK-8）；辣椒酱Gochujang含少量长链MK。PCA（PC1 65.0%，PC2 25.0%）将样品按MK谱聚类：Natto与Doenjang（富MK-7/MK-6/MK-8，Bacillus关联）、Douchi与Hamanatto（痕量MK-9，Lactococcus关联）、仅含PK的味噌及腐乳类（负相关长链MK）。结论：发酵豆制品中长链MK的有无及类型直接反映主导微生物（Bacillus subtilis → MK-7；Lactococcus → MK-8；高盐抑制Bacillus → 仅PK），亚洲非日本发酵豆制品亦是长链维生素K的重要膳食来源。

讨论与结论翻译（Conclusions）

本研究建立了一种改进的柱切换-高效液相色谱-荧光检测（Column-Switching HPLC-FLD）方法，可同时测定主要维生素K形式（PK、MK-4、MK-7）及长链甲基萘醌（MK-6、MK-8、MK-9）。该方法通过内置柱切换系统免去样品纯化步骤，可直接分析提取液；使用经济的甲醇/2-丙醇流动相及常规HPLC系统，相较于LC/MS方法更具实用性和可及性。将此法应用于发酵食品发现：纳豆（日本）、豆豉（中国）和大酱（韩国）总维生素K含量高；咸纳豆（日本）和臭豆腐（中国）的特征为长链甲基萘醌（尤其MK-8）水平升高。值得注意的是，中国和韩国发酵豆制品首次被确认为除日本纳豆外的重要膳食长链维生素K来源。总体而言，本方法能高效、灵敏地分析复杂食品基质中主要及长链维生素K同类物，其在营养学、生物化学、体内研究及多样化发酵食品维生素K评价中具有广泛应用潜力。