小鼠黑色素瘤过继性T细胞治疗(ACT)期间淋巴结中性粒细胞的纵向空间分布分析揭示肿瘤引流与非引流淋巴结不同的浸润模式

《npj Systems Biology and Applications》：Longitudinal spatial neutrophil profiling during ACT in murine melanoma reveals distinct lymph node infiltration patterns

　　

在过继性T细胞治疗（Adoptive T cell therapy，ACT）过程中，反应性中性粒细胞浸润可抑制肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph node，tdLN）中CD8+T细胞的扩增，但其时空调控机制尚不完全清楚。研究人员利用流式细胞术和多色免疫荧光（multiplex immunofluorescence）数据，对接受ACT治疗的黑色素瘤小鼠模型中tdLN与非肿瘤引流淋巴结（non-tumor-draining lymph node，non-tdLN）内免疫细胞动态变化进行了时间分辨定量评估。结果显示，治疗后早期，过继转移的肿瘤反应性CD8+T细胞即在淋巴结中聚集并扩增，其中tdLN中有利于疗效的中心记忆CD8+T细胞（TCM）表型频率最高。增强黑色素瘤细胞内先天免疫信号可促进中性粒细胞向淋巴结（尤其是non-tdLN）的涌入；然而在tdLN内部，中性粒细胞富集于T细胞区（T cell zone），而该区域同时也含有最大绝对数量的过继转移CD8+T细胞。综上所述，上述发现表明在ACT期间，受肿瘤先天免疫信号强度影响，tdLN与non-tdLN在早期中性粒细胞动力学及区室化分布上存在差异。

《npj Systems Biology and Applications》刊载论文解读：小鼠黑色素瘤ACT期间tdLN与non-tdLN中性粒细胞纵向空间分布特征研究

研究背景与立题依据

过继性T细胞治疗（Adoptive T cell therapy，ACT）是实体瘤（如黑色素瘤）极具前景的免疫治疗方案，其中CD8⁺T细胞是介导疗效的主要效应细胞，其长期存活与自我更新能力依赖于中心记忆CD8⁺T细胞（central memory CD8⁺T cells，T_CM，表型CD44⁺CD62L⁺）亚群，肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph node，tdLN）是T_CM的重要储库。既往研究表明，中性粒细胞在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）及tdLN中具有免疫抑制潜能，可限制CD8⁺T细胞功能，但其向不同解剖部位淋巴结（tdLN vs non-tdLN）的时空募集规律、空间定位及其与ACT诱导的免疫应答间的关系尚未阐明。为此，研究人员构建了小鼠黑色素瘤ACT模型，纵向量化tdLN、对侧非引流淋巴结（contralateral lymph node，clLN，即non-tdLN）及同侧臂淋巴结（作为中间淋巴结intLN）中中性粒细胞与过继转移Pmel-1 CD8⁺T细胞的动态变化及空间分布，探讨先天免疫刺激对上述过程的影响。

主要关键技术方法

研究使用C57BL/6小鼠皮下接种HC.PmelKO.CDK4^R24C-NFhgp100黑色素瘤细胞建立移植瘤模型，肿瘤达3–5 mm直径时启动标准ACT方案——腹腔注射环磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）预处理，次日经尾静脉回输200万源自Pmel-1 TCR转基因小鼠的na?ve Pmel-1 CD8⁺T细胞并联合重组腺病毒Ad-hgp100体内激活，分别于ACT当天及第3、6、9天行瘤内注射CpG/聚肌胞苷酸（CpG/Polyinosinic:polycytidylic acid，CpG/Poly(I:C)）激活先天免疫；设省略CpG/Poly(I:C)注射的对照队列。分别于纳未荷瘤（Na?ve）、荷瘤未治（Tumor-bearing）、Cy处理后1天（Cy）及ACT后第3、7、14天和复发（Relapse）时间点取材，每个体采集tdLN（同侧腹股沟LN）、clLN（对侧腹股沟LN，作non-tdLN）及右臂淋巴结（brachial lymph node，brLN，作intLN）。分别进行多参数流式细胞术分析免疫细胞频率与微珠校正绝对细胞数，以及PhenoCycler（原CODEX平台）多色免疫荧光成像结合单细胞分割、Leiden聚类注释细胞类型及基于k-近邻的空间分区（划分为T细胞区、B细胞滤泡及髓质/被膜下窦/滤泡间区构成的Intermediate zone），并进行跨模态相关性验证与统计分析。

研究结果

Neutrophils infiltrate predominantly into the distant contralateral lymph node (clLN) compared to the tdLN during ACT（ACT期间中性粒细胞主要浸润至远侧对侧淋巴结clLN而非tdLN）

通过流式细胞术检测发现，ACT启动后第3天起中性粒细胞开始渗入各淋巴结，第7–14天明显增多；相对细胞频率上，clLN（non-tdLN）中中性粒细胞占比显著高于tdLN（p＜0.05），intLN呈类似但较弱趋势。与之对应，过继Pmel-1 T细胞在第3–7天聚集于淋巴结，tdLN中Pmel-1 T细胞以T_CM（CD44⁺CD62L⁺）为主，而clLN中以终末分化效应CD8⁺T细胞（terminally differentiated effector CD8⁺T cells，T_EFF，表型CD44⁺CD62L^?）为主，证实tdLN是有利于长生存期T_CM形成的独特免疫微环境。

Spatial analysis reveals enhanced T cell zone infiltration in the tdLN compared to the clLN（空间分析显示tdLN中侵入T细胞区的中性粒细胞多于clLN）

应用30标记多色免疫荧光成像鉴定出22种空间定位明确的细胞类型，与流式数据Spearman秩相关系数为0.87。将淋巴结分为T细胞区、B细胞滤泡和中间区（髓质/被膜下窦/滤泡间区）后发现：大多数中性粒细胞定位于中间区，该区clLN中中性粒细胞占比较tdLN高（ACT第14天分别约6% vs 3%）；进入T细胞区的中性粒细胞比例以tdLN显著高于clLN（p＜0.05）；clLN中位于T细胞区外的中性粒细胞多距离T细胞区边界＞20 μm（约5个细胞直径），而tdLN中中性粒细胞与T细胞区空间邻近性更强，提示tdLN内中性粒细胞–CD8⁺T细胞潜在互作机会更多。

Profound changes in lymph node sizes and architecture facilitate immune response in ACT（ACT中淋巴结大小与结构显著改变以支持免疫应答）

tdLN从Na?ve到Relapse体积增大约10倍（活细胞数由10⁷增至10⁸），Cy处理后轻微（无统计学显著）缩小但不破坏结构，ACT第7天起tdLN显著大于clLN和intLN（p＜0.001），clLN大小全程稳定。鉴于tdLN绝对细胞数剧增，虽Pmel-1 T细胞在tdLN与clLN中占总CD45.2⁺细胞比例相近，但tdLN中Pmel-1 T细胞绝对计数显著更高（p＜0.01），再次确认tdLN是过继T细胞主要储库；反之中性粒细胞虽在clLN中比例偏高，但绝对数低于tdLN。说明评估免疫细胞调控必须结合绝对计数与器官增生情况。

Intratumoral innate immune stimulation triggers infiltration of neutrophils in the lymph nodes and promotes T_CMcells in the tdLN（瘤内先天免疫刺激触发淋巴结中性粒细胞浸润并促进tdLN中T_CM细胞形成）

去除CpG/Poly(I:C)瘤内免疫刺激后，各淋巴结中性粒细胞浸润程度普遍降低，tdLN与clLN间中性粒细胞比例差异缩小；同时tdLN中T_EFF比例上升、T_CM比例下降，致使两淋巴结间T_EFF与T_CM比例差异消失，但肿瘤内Pmel-1 T细胞亚群及淋巴结大小无明显变化。表明瘤内CpG/Poly(I:C)介导的先天免疫信号是放大non-tdLN中性粒细胞招募及维持tdLN内有利T_CM表型所必需的。

讨论与结论总结

研究人员发现ACT期间non-tdLN（尤clLN）中性粒细胞相对丰度高于tdLN，这与预期中肿瘤源性因子优先招募中性粒细胞至tdLN不同，且此差异部分依赖瘤内先天免疫配体（CpG/Poly(I:C)）引发的全身I型干扰素等信号调控局部趋化因子（如CXCL2–CXCR2轴）表达。空间分析揭示尽管tdLN整体中性粒细胞占比偏低，但进入T细胞区的中性粒细胞比例高于clLN且与大量过继CD8⁺T细胞空间共定位，可能通过PD-L1等机制发挥免疫抑制或依表型具早期抗肿瘤双重作用。tdLN在ACT中显著增生，使其仍保有最大绝对值的过继T细胞与一定量中性粒细胞。取消先天免疫刺激削弱中性粒细胞反应并减少tdLN内T_CM比例，提示先天信号协同塑造中性粒细胞与T细胞区室。该研究强调评估ACT免疫动力学需同时考虑tdLN与远端淋巴结构成差异及器官绝对细胞计量，超越传统肿瘤–tdLN轴心而视淋巴系统为整体。

原文结论段翻译：

在ACT期间，过继转移的肿瘤反应性CD8⁺T细胞在治疗后迅速扩增，其中tdLN中含有最高比例的有利于疗效的T_CM表型。增强肿瘤内先天免疫信号促进中性粒细胞招募，以non-tdLN中最显著；然而tdLN内中性粒细胞富集于T细胞区，且该区含最大绝对量的过继转移CD8⁺T细胞。综上，这些数据揭示了受肿瘤先天免疫信号调控，ACT期间tdLN与non-tdLN存在不同的早期中性粒细胞动力学及空间组织模式。本研究聚焦ACT中的淋巴结区段，强调了中性粒细胞反应的行为多样性、复杂性及情境依赖性。研究人员共享所有相关资源以促进后续分析与建模研究。本工作凸显了将视野从传统肿瘤–tdLN轴向扩展至整体淋巴系统的重要性。