通过单细胞核转录组学解析肝纤维化相关Mallory-Denk小体发生中的HGF/MET轴作用

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Unraveling the HGF/MET axis in Mallory-Denk body pathogenesis associated with liver fibrosis through single-cell transcriptomics

　　

摘要：Mallory-Denk小体(MDBs)是慢性肝病(包括肝纤维化)中常见的蛋白聚集体，但驱动MDB发生及纤维化进展的肝内细胞间互作机制仍不清楚。研究人员利用单细胞核RNA测序(snRNA-seq)鉴定了显著的细胞异质性及一类独特的肝细胞亚群——MDB相关肝细胞(MAHs)，其与肝细胞肝癌(HCC)进展密切相关。研究定义了4个肝星状细胞(HSC)亚群，其中活化HSC(aHSCs)是与MDB相关的独特亚型。此外，研究人员揭示了一个由MAHs、aHSCs和库普弗细胞(KCs)紧密连接的轴，证明异常的肝细胞生长因子(HGF)/上皮-间质转化因子(MET)信号参与MDB发生。机制上，aHSCs或KCs分泌的HGF与气球样变性MAHs上的MET结合，通过蛋白磷酸化激活HGF/MET下游PI3K/AKT/NF-κB和STAT3通路。活化的HGF/MET通路促进泛素D(UbD)上调及促炎细胞因子TNFα释放，后者进一步促进HGF转录，形成正反馈环路并促进MDB形成。此外，aHSCs通过HGF/MET轴调控STAT3促进MDB发生，并通过刺激TGFβ1分泌增加HSC活化，从而在3D MDB类器官培养中加速纤维化。值得注意的是，UbD缺陷(UbD-/-小鼠)抑制HGF/MET信号和MDB形成，减轻肝纤维化；人含MDB肝活检组织中HGF/MET信号也显著升高。这些发现从单细胞层面揭示了MDB发生过程中肝细胞重编程及肝内互作的新见解，并提示HGF/MET/UbD轴可作为慢性肝病的潜在治疗靶点。

论文解读：通过单细胞核转录组学解析肝纤维化相关Mallory-Denk小体发生中的HGF/MET轴作用

Mallory-Denk小体(MDBs)是见于酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化及肝细胞肝癌(HCC)等慢性肝病肝细胞胞质内的角蛋白8(K8)/K18、p62和泛素D(UbD/FAT10)聚集的包涵体，反映26S蛋白酶体功能障碍。目前已知MDB形成肝细胞具祖细胞样特征且与HCC相关，但MDB发生中肝细胞的异质性重编程及具体肝内细胞互作机制不明。肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化核心事件，库普弗细胞(KCs/肝脏定居巨噬细胞)亦参与炎症-纤维化网络，然而三者在MDB病理微环境中的配体-受体互作尚未阐明。本研究旨在通过snRNA-seq解析MDB相关肝单细胞转录组景观，明确关键细胞亚群及信号轴，并在体内外验证HGF/MET/UbD轴在MDB形成与纤维化中的作用及机制。该论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

主要关键技术方法

建立DDC(3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可啉啶)饲喂诱导小鼠MDB形成模型(含撤药及再饲喂组)，取肝组织进行单细胞核RNA测序(snRNA-seq)获得35,588个高质量核转录组，进行UMAP聚类、差异基因分析、细胞通讯(Ligand-Receptor)及CytoTRACE分化潜能、InferCNV拷贝数变异分析；利用TCGA-LIHC及公共snRNA-seq数据集(GSE202379等)进行肝细胞亚群反卷积与生存分析；分离DDC小鼠肝细胞建立3D MDB类器官(MDO)并与小鼠HSC系JS-1共培养；采用CRISPR/Cas9构建UbD^-/-小鼠验证功能；通过HGF处理、MET抑制剂(PF-02341066)及PI3K抑制剂(LY294002)干预MDB形成性Hepa1-6细胞及类器官；Western blot、RT-qPCR、ELISA及免疫荧光检测通路分子与MDB标志物。

研究结果

MDB formation is a heterogeneous pathological process associated with liver fibrosis and the development of cholestatic liver injury

DDC饲喂小鼠出现肝肿大、转氨酶升高、胆管反应、纤维化、肝细胞气球样变、脂滴沉积及MDB形成(p62与K8共定位)。snRNA-seq鉴定出9大类肝细胞(肝细胞、内皮细胞、树突状细胞、胆管上皮细胞、HSC、KC、T细胞、B细胞、周期细胞)；MDB肝中KC、HSC及胆管上皮细胞比例上升，肝细胞比例略降。证实MDB发生伴随胆汁淤积性肝损伤与明显细胞异质性。

Emergence of MDB-associated hepatocytes (MAHs) and their molecular signature

肝细胞再聚类得到Hep0–Hep5六个亚群，其中Hep4和Hep5在DDC饲喂/再饲喂组中显著扩增，高表达MDB标志物K8、K18、Sqstm1(p62)和UbD，定义为MDB相关肝细胞(MAHs)。Hep4富集于癌症与HCC通路，Hep5富集于氧化磷酸化及神经退行性疾病相关通路，且高表达Slc7a11和线粒体基因。

MAH subsets are closely associated with HCC progression

CytoTRACE显示Hep4具最高分化潜能(干性)，Hep5较成熟。InferCNV示Hep4有chr1/chr6拷贝数增益，Hep5基因组不稳定性高(chr19增益)。TCGA-LIHC反卷积显示Hep4比例高者总生存差；MDB标志物(K8、Sqstm1、UbD、Slc7a11)随脂肪肝→脂肪性肝炎→HCC进展上调，Slc7a11高表达预示HCC不良预后，提示MAHs特别是Hep4参与HCC恶性演进。

snRNA-seq reveals distinct HSC subpopulations involved in MDB formation

HSC再聚类鉴定出静息HSC(qHSCs)、活化HSC(aHSCs，高表达Itgbl1、Mmp14)、Mmp14-Bmp2⁺和Mmp14-IL7r⁺四个亚群。aHSCs与Mmp14-IL7r⁺在MDB肝中显著扩增，富集ECM-受体互作、PI3K-AKT及TGFβ通路，高表达基质金属蛋白酶(Mmp2、Mmp14等)。人HCC伴MDB组织中MMP14与α-SMA共升高，高Mmp14表达关联更短生存，提示aHSC异质性参与MDB相关纤维化。

The HGF/MET axis in hepatocyte–macrophage–HSC interactions

细胞通讯分析显示HGF(配体)—MET(受体)互作在MAHs与KCs/aHSCs间显著富集。HGF/MET下游PI3K/AKT/NF-κB在Hep4/Hep5中被GSVA证实激活。MDB形成性Hepa1-6细胞与共培养Raw264.7巨噬细胞促使巨噬细胞分泌HGF增加。建立DDC小鼠原代3D MDB类器官(MDOs)稳定传代并高表达K8、UbD、p62；MDOs条件培养基诱导JS-1 HSC分泌TGFβ1和Mmp14升高，MET抑制后减弱。DDC小鼠血清及人HCC伴MDB组织HGF水平升高。

The HGF/MET axis mediates liver MDB formation via NF-κB and STAT3 signaling

HGF处理MDB形成性Hepa1-6细胞上调UbD及PI3K/AKT/NF-κB组分mRNA；诱导MET、AKT、IκBα磷酸化(峰值72 h)。PI3K或MET抑制剂降低磷酸化水平。人MDB-HCC组织p-MET、p-AKT、p-IκBα升高且与p62⁺气球样肝细胞共定位。MET抑制剂处理MDOs减小类器官体积，下调p-AKT、p-IκBα、K8、p62、p-STAT3及UbD，证实HGF/MET经PI3K/AKT/NF-κB和STAT3促MDB形成。

UbD deficiency inhibits HGF/MET signaling and liver fibrosis

SCENIC示NF-κB1(p50)、Jun在Hep4激活；UbD启动子具NF-κB及STAT3结合位点。CRISPR/Cas9构建UbD^-/-小鼠，DDC诱导后UbD^-/-肝MDB标志物(UbD、K8、p62)、HGF/MET通路磷酸化(p-MET、p-IκBα)及TNFα分泌显著低于野生型；纤维化基因(Acta2、Col1a1、Col3a1、Col4a1、Mmp14)及α-SMA、Vimentin表达下降，组织学示MDB、胶原沉积、脂滴及aHSC标记减少，CCl₄联合诱导模型中表型一致，证明UbD缺失阻断HGF/MET信号正反馈并减轻MDB形成与纤维化。

讨论与结论

研究人员通过snRNA-seq首次在单细胞分辨率下描绘了DDC诱导MDB肝的细胞图谱，鉴定出MDB相关肝细胞亚群MAHs(Hep4/Hep5)及其与HCC进展的关联，发现HSC活化亚群aHSCs高表达Mmp14。细胞互作分析揭示aHSCs和KCs分泌HGF作用于MAHs表面MET，异常激活PI3K/AKT/NF-κB和STAT3通路，上调UbD及促炎因子TNFα，TNFα又促进HGF转录形成正反馈环路驱动MDB包涵体形成；同时MDB形成肝细胞通过TGFβ1活化HSC促进纤维化。UbD敲除小鼠中HGF/MET信号减弱、MDB形成受抑、肝纤维化减轻，人含MDB肝组织HGF/MET信号升高，验证了HGF/MET/UbD轴的核心地位。结论：慢性肝损伤时，活化的HSC和KC分泌HGF结合气球样MAHs上MET，激活PI3K/AKT/NF-κB和STAT3通路，促进UbD上调及TNFα释放形成正反馈，致MDB形成；aHSCs经HGF/MET-STAT3促MDB且被MDB肝细胞TGFβ1活化加速纤维化；UbD缺失抑制该轴并减轻病变。HGF/MET/UbD轴是MDB相关慢性肝病潜在的诊疗靶点。