异质Stock(Heterogeneous Stock, HS)大鼠可卡因自我给药行为的全基因组关联分析(Genome-wide Association Study, GWAS)

《Nature Communications》：Genome-wide association study of cocaine self-administration behavior in Heterogeneous Stock rats

　　

研究人员对836只N/NIH异质Stock(Heterogeneous Stock, HS)大鼠(雌性415只，雄性421只)开展全基因组关联分析(Genome-wide Association Study, GWAS)，检测与可卡因使用障碍(Cocaine Use Disorder, CUD)相关的表型，包括自我给药获得(acquisition of self-administration)、摄入 escalation(escalation of intake)及强迫样反应(compulsive-like responding)。这些性状具表型相关性，且显示较低至中等单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)遗传力(h2＝0.07–0.16)。研究人员鉴定出6个全基因组显著关联位点(－log10(p)≥5.58；经置换检验α＝0.05)。其中19号染色体一个位点与可卡因输注后间隔(post infusion interval, 即两次可卡因输注间的时间)变异相关，含多个与人CES1基因直系同源(orthologous)的羧酸酯酶(carboxylesterase)基因，羧酸酯酶可代谢可卡因；该位点中Ces1c和Ces1d基因的3个错义非同义编码变异(missense non-synonymous coding variants)与该位点呈完全连锁不平衡(perfect linkage disequilibrium)。其余5个位点含具潜力的编码变异和表达数量性状位点(expression Quantitative Trait Loci, eQTL)，包括Trak2(既往人GWAS中已报道与CUD关联)及Slc10a7、Plcl1、Satb2(曾报道与酒精及烟草使用障碍关联)。本研究为迄今最大规模的大鼠可卡因自我给药遗传学研究，结果复现了人CUD GWAS中既往报道的位点，并提供若干新生物学见解，包括靶向羧酸酯酶药理学策略的潜在价值。

《Nature Communications》刊发HS大鼠可卡因自我给药行为GWAS研究的解读

研究背景与立项依据

可卡因使用障碍(Cocaine Use Disorder, CUD)是重大公共卫生问题，特定介导CUD的基因仍大多未知。双生子研究估测可卡因依赖遗传度(heritability)高达70%，人全基因组关联分析(Genome-wide Association Study, GWAS)显示SNP遗传力(h²)约27%–30%，但已报道的全基因组显著关联基因极少(FAM53B、NCOR2、TRAK2、LINC01411、LPHN2、FAM78B等)，样本量限制与表型异质性制约了发现。啮齿类模型可在严格受控条件下解析CUD样行为的遗传基础：N/NIH异质Stock(Heterogeneous Stock, HS)大鼠具高度遗传异质性及较低连锁不平衡(Linkage Disequilibrium, LD)，相比近交系或F₂群体有更高定位精度，且允许统一环境、控制药物暴露、记录精确给药模式(如输注后间隔post infusion interval)及进行行为经济学(如渐进比率progressive ratio, PR)测评，还可做基因操作验证机制。此前HS大鼠已用于多类复杂性状GWAS，但缺乏大规模可卡因自我给药(intravenous cocaine self-administration)的GWAS。因此研究人员扩大样本，对近900只经历延长接触(extended access)可卡因静脉自我给药的HS大鼠行GWAS，并结合编码变异与eQTL整合分析，以鉴定CUD样行为的易感/耐受基因。

主要关键技术方法

研究人员使用20批次N/NIH HS大鼠(n≈836最终入组，雌性415、雄性421)，进行颈外静脉置管术后，依次完成：短时可及(Short access, ShA；2 h/日×10日)可卡因(0.5 mg/kg/infusion)自我给药(FR1)、PR测试、长时可及(Long access, LgA；6 h/日×14日)自我给药、PR测试、部分耦联足电击(punishment test)及PR测试；记录各时段总输注数、输注时间戳、主动/被动杠杆按压数，计算早期/晚期平均输注量、输注后间隔(post infusion interval, 中位输注间隔时间)、负荷(loading)、滴定(titration)、超时按压差(timeout)、PR总按压数、休克耐受性等表型，并对LgA多维度表型做主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)提取LgA PC1成瘾样行为(addiction-like behavior)。表型去除协变量(年龄、批次、性别、毛色、体重)影响后分位数正态化。脾组织提取DNA行低深度全基因组测序(low-coverage Whole Genome Sequencing)，比对至mRatBN7.2参考基因组，用STITCH基于单倍型推断基因型，质控后保留5,446,333个高质量SNP(MINOR ALLELE FREQUENCY, MAF＞0.005，imputation INFO≥0.9，缺失率＜0.1，Hardy-Weinberg Equilibrium p＞1×10^?10)。采用Genome-wide Complex Trait Analysis(GCTA)软件混合线性模型(mixed linear model, MLMA)，以全常染色体遗传关系矩阵(Genetic Relatedness Matrix, GRM)及Leave-One-Chromosome-Out(LOCO)法校正群体结构，计算SNP遗传力(restricted maximum likelihood, REML)及关联；全基因组显著性阈值由1000次置换检验确定(－log₁₀(p)＝5.58，α＝0.05)；显著位点内检索RatGTEx数据库cis-eQTL、剪接QTL(sQTL)及Ensembl Variant Effect Predictor注释错义编码变异(r²＞0.6)。

研究结果

HS rats exhibit wide variation in cocaine self-administration(HS大鼠可卡因自我给药呈广泛个体变异)

ShA与LgA期间大鼠可卡因摄入量存大幅个体差异，部分大鼠维持低摄入，部分在LgA末期超150次输注/日。行为性状两两Spearman相关多显著且聚类为若干子模块：早期/晚期获得聚类(多源自ShA)、LgA摄入升级聚类(多源自LgA)、输注后间隔(post infusion interval, ShA与LgA期均聚一起，提示为稳定特质，与其他簇中度负相关——高摄入则间隔短)、超时(TO)/PR/休克聚类(反映不顾不良后果的觅药动机)。表明所测维度共属"成瘾样行为"构念，受共同遗传/环境因素部分调控。

Principal component analysis of cocaine self-administration(可卡因自我给药的主成分分析)

对LgA衍生的11项表型(早/晚输注后间隔、平均输注、负荷、滴定、超时及LgA总输注)做PCA，第一主成分(PC1)解释55%方差，定义为"LgA PC1 addiction-like behavior"，整合多行为域信息，用作下游GWAS表型。

GWAS(全基因组关联分析)

对27个行为表型(ShA、LgA、PR、休克相关)行GWAS，鉴定6个全基因组显著关联(－log₁₀(p)≥5.58)：ShA early post infusion interval、LgA late average infusions、ShA early timeout、LgA late post infusion interval、LgA PC1 addiction-like behavior、LgA early titration，关联跨越不同行为簇，提示遗传因素影响多层面可卡因自我给药。

Heritability(遗传力)

各性状SNP遗传力h²＝0.07–0.16，最高为LgA PC1 addiction-like behavior(h²＝0.16, p＝0.005)；LgA总输注h²＝0.13(p＝0.009)，数ShA/LgA性状呈显著遗传力(p＜0.05)，表明成瘾样行为遗传信号随药物暴露延长增强。

Locus for LgA late post infusion interval(与LgA晚期输注后间隔关联的19号染色体位点)

19号染色体～13.8–14.05 Mb LD块(峰值SNP 19:13,896,276, －log₁₀(p)＝5.61)含Ces1c与Ces1d基因(人CES1直系同源)，编码可代谢可卡因的羧酸酯酶1(carboxylesterase 1, CES1)；该LD块内3个错义变异——Ces1d: c.557A＞G(p.Q186R)、c.1269G＞A(p.M423I)；Ces1c: c.1226C＞T(p.P409L)——与峰值SNP近乎完全LD(r²＞0.99)。此区域还含Rasd2(纹状体富集Ras同源蛋白，与可卡因敏化相关)脑区eQTL(r²＝1.0，伏隔核核心nucleus accumbens core、前边缘皮层prelimbic cortex、全脑)及Slc6a2(去甲肾上腺素转运体norepinephrine transporter, NET编码基因，可被可卡因抑制)但不含其显著变异/ eQTL故非驱动因子。次要等位频率48%；GG纯合子LgA输注后间隔更短(对应高摄入/高成瘾样特征)，CC纯合子间隔更长。

Loci for additional cocaine self-administration traits(其余可卡因自我给药性状关联位点)

① LgA PC1 addiction-like behavior—19号染色体(~29.567 Mb, －log₁₀(p)＝5.98)，含Lsm6(RNA结合/剪接)脑eQTL及sQTL，及人SUD GWAS报道基因Slc10a7(与吸烟/尼古丁依赖关联)。

② ShA early post infusion interval—3号染色体(163,216,140 bp, －log₁₀(p)＝5.997)，含Zfp831锌指蛋白7个错义变异(r²＝1.0)及其杏仁核eQTL，旁及Ctsz(组织蛋白酶Z cathepsin Z)错义变异+eQTL、Gnas(G蛋白刺激α亚基) eQTL(外侧缰核lateral habenula、伏隔核核心、前边缘皮层)。

③ LgA late average infusions(摄入升级)—6号染色体(34,284,564 bp, －log₁₀(p)＝6.25)，含Rad51ap2(RAD51相关蛋白2，DNA修复)6个错义变异(r²＝1.0)及Vsnl1(视清蛋白样蛋白1 visinin-like protein 1，神经元钙传感器) sQTL。

④ ShA early timeout(反映爆发性按压/持续反应)—9号染色体(57,520,529 bp)，无高LD编码变异/eQTL，但含与人酒精/烟草/可卡因使用GWAS重叠基因Plcl1(磷脂酶C like 1)、Satb2(SATB homeobox 2)、Trak2(TRAFFICKING Kinesin Binding Protein 2，人TRAK2同源基因，人CUD GWAS阳性位点)，SNP与之呈中度LD(0.5＜r²＜0.7)。

讨论部分总结(翻译核心结论)

研究人员通过对HS大鼠延长接触可卡因自我给药模型行GWAS，鉴定多个CUD样行为显著关联位点，最值得注意的是含Ces1c/Ces1d错义变异(编码可卡因代谢酶CES1同源物)的区域与输注后间隔关联。双生子研究估测可卡因使用/依赖遗传度~0.3–0.7，人CUD SNP遗传力~0.3，本研究中HS大鼠CUD样性状SNP遗传力0.07–0.16，最高为整合多行为域的LgA PC1(0.16)，说明成瘾样行为遗传影响随药物暴露延长增强，用主成分整合表型可提升定位力。人CUD GWAS报道基因少，本研究在大鼠中复现人CUD GWAS阳性基因Trak2(大鼠Trak2)，其余新基因Slc10a7、Plcl1、Satb2亦在人其他物质使用障碍(烟/酒)GWAS中出现，体现SUD共享遗传基础。19号染色体Ces1位点关联输注后间隔，Ces1/CES1水解可卡因为无活性代谢物影响脑内药物动力学，符合"强迫区(compulsion zone)"理论——大鼠维持血药浓度于启动阈以上/饱厌阈以下而调节输注间隔；虽未直接测代谢速率，但Ces1变异可能通过改变酶活影响PK/PD从而调变行为，支持CES1为干预靶点的潜力。其余位点eQTL/sQTL涉及奖赏(伏隔核Rasd2、Gnas)、执行控制(前边缘皮层Rasd2、Gnas、Vsnl1、Lsm6)、情绪/应激(杏仁核Zfp831、Lsm6)等成瘾相关回路基因(Rasd2调多巴胺能传递，Gnas偶联D1类受体，Trak2互作GABA_A受体转运蛋白影响抑制性调控)。HS大鼠确保所有个体均有机会接触可卡因，故GWAS偏向捕获物质特异性因素(如Ces1代谢酶)而非仅影响初尝行为的冲动性等跨物质共有因素。本研究为迄今最大规模的大鼠可卡因自我给药遗传学研究，鉴定6个全基因组显著位点，复现人CUD关联基因Trak2，新发现Ces1c/d为潜在药理靶点，证明遗传多样远交系大鼠联合精细行为表型与多组学注释可高效发掘SUD相关基因及通路，样本及数据存Cocaine Biobank及UCSD数字馆藏供后续跨物种验证。