流感共感染抑制人体挑战模型中对分枝杆菌感染的控制

《Nature Communications》：Influenza coinfection inhibits control of mycobacterial infection in a human challenge model

　　

研究人员利用人体流感挑战研究中的全血发光分枝杆菌生长抑制试验（MGIA），证实流感感染可降低对分枝杆菌生长的免疫控制功能。对受试者感染流感前后血液的转录组测序、细胞因子及细胞学分析显示，流感激活了先天性免疫通路（包括I型干扰素信号通路），但这些通路对分枝杆菌的后续反应性降低，多个基因对卡介苗（BCG）lux感染的反应因流感共感染而受到抑制。数据表明，流感感染损害了控制分枝杆菌生长的免疫机制，可能是结核病（TB）发病的危险因素。流感疫苗接种或可为高风险、高患病率人群提供针对TB病的保护。

**研究背景与问题**

结核病（TB）仍是全球发病率和死亡率的主要原因之一。每年数以百万计的人暴露于并感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），但大多数感染者并不发展为疾病。Mtb感染现被认为是一个动态连续过程，从潜伏感染到具有潜在致命性的破坏性病变，其结局反映了宿主免疫防御与分枝杆菌毒力机制之间持续平衡的结果。除营养不良、HIV感染及其他免疫抑制状态等已确立的影响因素外，与其他病原体的共感染日益受到关注，被认为可能是促进活动性TB进展的因素。

人类一生中会暴露于多种病原体，越来越多的证据表明由此产生的免疫反应可能改变对其他感染的易感性。例如，流感病毒感染通过包括免疫调节在内的多种机制，增加继发细菌感染（如肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌感染）的风险。流行病学和动物模型研究提示，流感共感染可能通过调节对分枝杆菌控制重要的免疫通路，增加TB易感性和改变Mtb感染后的临床结局，但人体研究有限，且多为观察性研究，结果不一。鉴于流感是全球广泛传播的病原体（估计每年约10亿例），理解其与Mtb的免疫相互作用对TB防控、免疫策略及新型宿主诊断具有重要意义。

分枝杆菌生长抑制试验（MGIAs）可测量全血或细胞在体外抑制分枝杆菌生长的能力，能够在同一模型中综合考虑多种免疫组分（细胞、抗体和细胞因子）及其随时间的相互作用。人挑战研究为在高度受控环境中观察病原体驱动的免疫反应提供了独特机会。

**研究设计与主要结论**

研究人员在人体流感挑战研究的框架内采用全血MGIA，利用重组报告菌株——牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette Guérin，BCG lux），其发光强度可对活分枝杆菌进行定量读数。此前研究已证实BCG lux MGIA可反映TB感染、HIV感染、BCG接种、维生素D、中性粒细胞耗竭及英夫利昔单抗治疗等不同情况下的抗分枝杆菌免疫反应差异。

该研究检验了以下假设：健康成人感染流感后会通过调节抗分枝杆菌免疫反应而改变全血分枝杆菌控制能力。志愿者接受甲型流感病毒挑战，并通过病毒学检测确认感染。研究人员在挑战前和挑战后分别从参与者采集血液，用BCG lux感染后进行培养，同时测量全血分枝杆菌生长以及转录组、细胞因子和细胞学对分枝杆菌感染的反应，并在同一受试者中进行前后比较。研究结果显示，全身性流感感染通过破坏先天性免疫通路（包括I型干扰素信号通路）降低了全血对分枝杆菌的控制能力，提示流感感染可能是TB发病的危险因素，而季节性流感疫苗等预防流感的干预措施可能也对TB具有保护作用。该论文发表在《Nature Communications》。

**关键技术方法**

研究纳入30名健康成人，经鼻接种甲型（H3N2）流感病毒，其中24人发展为PCR确认的流感感染（PCR阳性组），6人未感染（PCR阴性组）。研究采用的主要技术包括：（1）基于BCG lux的全血分枝杆菌生长抑制试验（MGIA）：在血液样本采集后4小时内进行，将全血与RPMI培养基1:1稀释后，加入BCG lux（终浓度2.3×10⁵ cfu/ml）共培养，0小时和72小时测量发光值计算生长比率（GR_72h）；（2）转录组学分析：对15名PCR阳性参与者的150份样本进行RNA测序，采用DESeq2进行配对差异表达分析，并用maSigPro进行时间动态聚类分析，结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路分析；（3）细胞因子检测：使用Meso Scale Diagnostics（MSD）U-plex和S-plex超敏电化学发光免疫分析法检测上清液中的IFN-α2a、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17A/F、IL-22和IL-23；（4）流式细胞术：对16名PCR阳性参与者的样本进行多色流式分析，检测CD3⁺CD4⁺ T细胞、CD3⁺CD8⁺ T细胞、CD3^-CD56⁺ NK细胞及CD14⁺⁺CD16^-经典单核细胞、CD14⁺⁺CD16⁺⁺中间型单核细胞、CD14⁺CD16⁺⁺非经典单核细胞等亚群中IFN-α、IFN-γ、TNF-α和IL-10的表达。

**研究结果**

**流感感染抑制分枝杆菌生长限制**：流感PCR阳性组在感染后采集的血液样本中，BCG lux的GR_72h（1.69）显著高于感染前（GR_72h=1.03），也显著高于PCR阴性组感染后样本（GR_72h=1.05），表明流感感染后直接的分枝杆菌生长限制降低。PCR阴性组前后GR_72h无显著变化。PCR阳性组的ΔGR_72h显著高于PCR阴性组（147% vs 77%）。

**受流感激活的宿主分枝杆菌反应基因对BCG lux的反应降低**：通过RNA测序的转录组分析，研究人员鉴定出63个基因的转录本对BCG的反应因流感感染而发生显著改变（BH校正p值≤0.05），其中7个基因表达增加，56个基因表达降低。这些基因中许多为干扰素刺激基因（ISGs），包括IFI6、IFI16、IFI35、IFI44、IFI44L、OAS1、OAS2、OAS3、RSAD2、DDX60、MX1和BST2等。通路分析显示，最显著富集的通路包括"流感发病机制中的高细胞因子血症/高趋化因子血症的作用"（adj. p=2.14×10^-7，z=-2.6）、"模式识别受体在细菌和病毒识别中的作用"（adj. p=0.00013）和"干扰素信号通路"（adj. p=0.00013，z=-2）。通过引入计算机估算的细胞比例进行二次DESeq2分析，结果与原始模型相似，提示转录组差异由转录调控而非单纯细胞比例变化驱动。

maSigPro时间序列分析鉴定出2,140个随时间和组间显著差异表达的基因，其中两个基因簇（簇1和簇2）与BCG lux感染反应相关。簇1（67个基因）包含LY6E、RSAD2、IFI44、IFI44L、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、IFITM1、MX1和IRF7等多个ISG，这些基因在感染前样本中对BCG lux有反应性，但在感染后基线表达已升高，对BCG lux无明显反应。簇2（104个基因）包括CASP7、CCL22、CCL8、CCL4、CXCL2、CCL3、IL12B、TNF和TICAM1等，富含多种免疫通路，其基线和峰值表达在感染后样本中更高。

**枢纽基因表达与感染后分枝杆菌生长限制降低的关系**：研究人员将63个相互作用基因通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，用cytoHubba鉴定出10个最高度互联的枢纽基因，均为ISG（RSAD2、MX1、OAS1、OAS2、OAS3、IFI6、IRF7、IFI35、BST2和IFI44L）。在感染后样本中，生长非限制者（Non-restrictors）的上述前6个枢纽基因基线表达显著高于限制者（Restrictors），且对这些基因的BCG lux反应性有降低趋势。

**流感感染后分枝杆菌反应中干扰素产生降低**：细胞因子检测显示，感染前样本中所有检测细胞因子浓度在BCG lux孵育后均升高。流感感染后，PCR阳性组基线IFN-α2a浓度显著高于感染前，且BCG lux孵育后IFN-α2a未显著增加。感染后基线IFN-γ浓度显著升高，但72小时BCG lux孵育后的峰值浓度与感染前无显著差异，提示流感感染可能减弱了对BCG lux的反应幅度。TNF-α在感染后基线和峰值浓度均显著升高，IL-10变化模式与IFN-γ相似。

**流感感染后分枝杆菌的细胞反应改变**：流式细胞术分析显示，流感感染后，BCG lux感染样本中IFN-α⁺经典单核细胞频率显著低于未感染样本，而这一差异在感染前不存在。感染后24小时BCG lux孵育的IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞频率有低于感染前的趋势（adj. p=0.08）。TNF-α⁺经典单核细胞在BCG lux感染后6小时有高于感染前的趋势（adj. p=0.052），而IL-10⁺经典单核细胞在感染后24小时BCG lux刺激下显著降低。

**讨论与结论**

研究人员通过功能性的全血MGIA在人体流感挑战模型中研究了全身性流感感染对抗分枝杆菌免疫的影响。研究发现流感感染损害了全血对分枝杆菌生长的控制，降低了生长抑制能力。这些发现与已发表的动物模型数据以及流行病学和观察性研究一致，包括季节性流感与TB的时间关联、季节性流感疫苗与TB发病率降低的相关性、上呼吸道病毒感染（包括流感）后TB进展增加，以及流感共感染时更高的分枝杆菌负荷等报道。该研究首次在人体中提供了TB-流感相互作用的确凿证据，并揭示了 underlying机制。

研究表明，流感感染后对流感反应的先天性免疫通路（包括I型干扰素信号通路）的先发激活，限制了这些通路随后对分枝杆菌感染的反应能力。生长限制者与非限制者之间ISG表达模式的差异提示，这可能是感染后分枝杆菌控制降低的关键机制。这与TB-流感共感染的小鼠模型报道一致，该模型显示流感感染后分枝杆菌生长增强，且I型干扰素信号通路起作用。

关于I型干扰素反应在TB发病机制中的作用，先前研究结论不一。小鼠模型多提示其有害作用，但近期非小鼠实验研究支持保护作用。该研究提供的证据表明，这些I型干扰素反应的影响取决于背景和时机：流感感染后背景性I型干扰素刺激的增加是有害的，因为它抑制了随后对分枝杆菌的I型干扰素反应，而这些反应本身对分枝杆菌控制是有益的。

研究还发现流感共感染后BCG lux刺激引起的IFN-γ和IL-10反应降低，这与已发表的分枝杆菌-病毒共感染小鼠模型一致。63个受流感与BCG lux相互作用而显著改变的基因涉及影响巨噬细胞、B细胞、T细胞和NK细胞等多种免疫过程的基因，以及调控多个下游基因表达的非编码基因，提示流感共感染导致功能缺陷的分子机制具有复杂性。

研究人员指出，用于TB诊断和/或预测的血液转录组标志物常包含ISG，许多在流感感染期间也会被扰动，这可能限制其区分流感和TB的能力。因此，在开发宿主基因标志物时需要考虑这些重叠的转录组特征。人类流感挑战模型为在高度受控环境中研究全身性流感感染对抗分枝杆菌免疫的影响提供了独特机会，同一受试者内的前后比较最大度减少了潜在混杂因素。

研究局限性包括样本量较小、使用体外BCG模型作为TB易感性的替代指标、以及无法直接从这些数据确定流感感染对TB暴露和感染后临床结局的影响。此外，TB主要是呼吸道病原体，血液模型不太可能完全反映原发感染部位的免疫相互作用。

研究最终表明，流感感染通过破坏对控制分枝杆菌重要的先天性免疫通路（包括I型干扰素信号通路）而降低全血对分枝杆菌的控制。数据提示流感感染可能是TB进展的危险因素，而预防流感的干预措施（如季节性流感疫苗）也可能对TB具有保护作用。鉴于包括I型干扰素信号通路在内的这些免疫机制在许多病毒中普遍存在，这种降低分枝杆菌控制的作用可能是更广泛的病毒现象，而非流感特有。这些发现支持开展干预试验以评估季节性流感疫苗接种对TB发病率影响的必要性。