基于系统发育学方法分类差异宿主关联性的产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）大肠埃希菌对断奶仔猪肠道定植的研究

《Scientific Reports》：Intestinal colonization of weaner pigs by extended-spectrum-β-lactamase-encoding Escherichia coli classified for differential host-association using a phylogenetics-based approach

　　

健康人类与动物肠道细菌是抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance，AMR）基因的重要储库。某些大肠埃希菌（Escherichia coli）谱系主导了AMR的全球传播，但其宿主特异性程度及其对传播的影响尚不清楚。本研究收集德国、英国、西班牙和越南来自牛、鸡、人类和猪的1,198株E. coli分离株，采用基于系统发育的生物信息学方法对其进行宿主关联性分类，非宿主关联分离株定义为"泛宿主型（generalists）"。为验证该分类，研究人员将代表宿主关联或泛宿主簇的17株产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）分离株制成混合菌液（cocktail），接种至三组断奶仔猪（未处理组、阿莫西林处理组或头孢噻呋处理组）。通过培养及分离株特异性PCR监测接种后56天内细菌排泌情况。定植发生于接种后24小时内，排泌量早期达峰值随后下降。仅17株中的12株在接种后被回收；4株被持续检出，包括1株猪关联、1株牛关联、1株鸡关联和1株泛宿主型分离株。这些发现提示该分类方法存在局限性、猪可能表现出较低的宿主选择性，和/或定植机制认知尚不完全。尽管如此，该模型成功识别出能够稳定定植的分离株，支持其在研究AMR E. coli宿主适应性方面的实用性。

研究解读：基于系统发育分类的ESBL大肠埃希菌在断奶仔猪肠道定植能力的验证研究

一、研究背景与立项依据

大肠埃希菌（Escherichia coli，E. coli）是人和动物肠道常见共生菌，也是抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance，AMR）基因特别是产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）基因的重要储库。不同E. coli谱系可呈现从严格宿主专一（specialist）到广泛跨宿主（generalist，泛宿主型）的分布特征，但目前基于系统发育（phylogeny-based）推断的宿主关联性是否能预测其在特定宿主体内的真实肠道定植（colonization）能力尚不明确。明确这一点对评估AMR E. coli跨宿主传播风险至关重要。本研究以断奶仔猪为体内模型，验证基于系统发育的宿主关联性分类框架能否反映ESBL-E. coli的实际定植表现，并筛选出具有稳定定植潜力的分离株。该论文发表于《Scientific Reports》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员基于前期构建的含1,198株E. coli（分离自德国、英国、西班牙和越南的健康/患病牛、鸡、人、猪及野猪，2003–2018年）全基因组泛基因组（pangenome）系统发育树，计算各分离株针对人、鸡、猪、牛的宿主特异性评分（host specificity score，基于系统发育邻株宿主来源比例几何均值）及跨宿主几何平均秩次定义泛宿主型（generalist）；从中筛选携带ESBL基因、毒力因子少、源自健康宿主且耐利福平（rifampicin，RIF）标记的17株代表性分离株制成混合接种物（cocktail，总10¹⁰CFU）。24头约8–9周龄断奶仔猪随机分三组（n=8）：对照组（CON，肌注生理盐水）、阿莫西林（Amoxicillin，AMX）处理组、头孢噻呋（Ceftiofur，CET）处理组，于接种前后短期给药。通过胃管一次性接种cocktail，长期采集直肠拭子（至56天 post-inoculation，p.i.），结合选择性琼脂培养、富集步骤及基于独特ORFan基因的多重PCR（multiplex-PCR）和实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）定性/定量检测各分离株排泌及死后肠腔内容物与组织定植情况；采用非度量多维尺度分析（Non-metric Multidimensional Scaling，NMDS）及分析相似性检验（Analysis of Similarities，ANOSIM）、曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）法评估定植能力，并以惰性颗粒胃肠转运数学模型对照判定真正定植。

三、研究结果

Host-association classification of the E. coli isolates from the collection（收集E. coli分离株的宿主关联性分类）

通过对1,198株E. coli泛基因组系统发育分析及宿主特异性评分计算，识别出与人（2簇）、鸡（1簇）、猪（5簇）、牛（7簇）相关的宿主特异性聚类及4个泛宿主型簇；野生来源野猪分离株因数量不足未单独建簇。许多携带ESBL基因的分离株因未达宿主特异性阈值被排除出后续实验候选。

Isolate selection for animal experiments（动物实验用分离株筛选）

在84株符合ESBL阳性等初筛条件的分离株中，进一步排除产大肠菌素（colicin）株及高毒力因子株，最终选取代表各宿主关联类别及泛宿主型的17株ESBL-E. coli（含1株同时归入Cattle4与Generalist2而按Cattle4纳入），均诱导RIF抗性以便选择性回收。

Shedding of E. coli isolates following experimental inoculation of weaner pigs（断奶猪实验接种后E. coli分离株的排泌动态）

接种后E. coli排泌百分比（CET+RIF或AMX+RIF耐药菌落占总肠杆菌比例）于2 dpi达峰值，CET组高于AMX组高于CON组；4–7 dpi各组间差异显著；8–12 dpi CET组仍显著高于其余两组；13 dpi起CON组低于检测限引入富集步骤，后续AMX与CET组相继引入富集。排泌峰较模拟惰性颗粒通过猪消化道时间延迟约1天，提示存在主动定植与增殖。

Influence of antimicrobial treatment on E. coli shedding patterns（抗菌药处理对E. coli排泌模式的影响）

NMDS与ANOSIM显示同一处理组内排泌谱相似度高于组间（R=0.12, p<0.001），而同一时间点各猪排泌谱相似度高于不同时间点（R=0.21, p<0.001），表明采样时间对排泌组成影响大于抗菌药处理类型；各处理组内不同个体在同一时间点较同一头猪不同时间点更相似，提示处理组内定植模式随时间是趋同的。

Qualitative shedding patterns of individual E. coli present in the cocktail（cocktail中各E. coli分离株定性排泌模式）

最初6 h pi即可检出多数分离株，5 dpi平均可回收12/17株，后期降至7–8株，富集后可短暂回升至8–9株。4株——Chicken1（ST1163）、Cattle1（ST362）、Pig3（ST410，携带bla_CTX?M?15）、Generalist1（ST162，被算法判定为泛宿主型）——在大部分动物中从头至尾持续检出，Generalist1检出率最高，Pig3次之；意外的是鸡与牛关联株也广泛持续排泌。另8株仅部分动物或部分时点检出（Pig1、Pig2偶发）；5株（含预期猪专一Pig5及Generalist3）几乎未检出或仅极个别时点单头猪微量检出。

Phylogeny-based classification method and colonization capacity（基于系统发育分类方法与定植能力的关联）

计算4–13 dpi各分离株排泌阳性动物百分比随时间的AUC，划为弱/中/强定植者。比较猪关联株与非猪关联株、猪+泛宿主型合并vs其他宿主关联株间AUC，均无显著差异，表明本实验条件下基于系统发育和分离宿主推断的宿主关联性不能预测猪体内定植能力。唯一跨处理组稳定强定植的是Generalist1和Pig3。

E. coli presence and diversity within the intestinal tract（肠道内E. coli存在与多样性）

死后剖检证实强定植株（Generalist1、Pig3等）各处理组均广泛分布于回肠、盲肠、近/远端结肠内容物与黏膜组织，部分位点未富集前组织样本未检出但富集后可见；CET组富集后分离株多样性最高；同一肠段组织与内容物检出情况不完全一致，提示定植具微环境异质性。

Quantitative colonization（定量定植分析）

仅对持续排泌的4强定植株行qPCR定量。整体肠段合并分析显示：Generalist1在AMX(p.adj=0.012)与CET(p.adj=2.3e-04)组定植量显著高于CON组；Chicken1在CET组显著高于CON组(p.adj=0.046)。盲肠Chicken1的AMX与CET间及CON与CET间有差异，近端结肠Generalist1的AMX、CET与CON间均有差异，其余位点/菌株组合无显著差异。

四、讨论总结与结论翻译

讨论指出，本研究猪模型证实部分ESBL-E. coli可在停用抗生素后长期存续，抗生素（尤其三代头孢如CET）通过破坏定植抗力（colonization resistance）促进外来菌定植，而AMX因耐药率高效应较弱。多分离株cocktail接种策略可模拟生产现场多菌株共暴露并节省动物。系统发育推断宿主关联性未预测猪定植成功，可能源于：分类标准不够严格或具背景依赖性；聚焦ESBL-E. coli富集了跨宿主谱系从而弱化宿主限制性；猪本身对E. coli定植选择性较低（与该文库全基因组关联研究中猪未发现特异宿主基因相吻合）。强定植株（ST162/ST410/ST1163/ST362）属全球流行且部分为高风险克隆，但并非所有广布ST均表现强定植，提示不同流行克隆定植机制有异。Generalist1（ST162，源于越南鸡但判为泛宿主）与Pig3（ST410，德/西猪/禽/牛源ESBL株）携多个耐药基因及可能黏附/铁摄取相关基因有助于持久定植，具体遗传基础待究。研究局限包扩仅测ESBL株及单一宿主模型。

结论部分原文翻译：

研究人员使用含17株ESBL-E. coli的cocktail建立了可重现的体内猪模型，能分辨分离株持续排泌差异，并证明基于富集的检测可发现非富集培养遗漏的低丰度定植菌。在测试条件下，猪体内的定植成功与否与基于系统发育和分离宿主推断的宿主关联性不吻合，表明仅凭此分类法无法预测该宿主中定植能力。由于研究聚焦ESBL-E. coli且用单一宿主模型，关于宿主特异性的结论受限；需借助其他宿主系统及不同分离株集合来判定偏差源于分类框架局限、ESBL谱系特性、宿主背景或综合因素。与此同时，cocktail策略可同步体内评估多分离株，并被证实用以识别具强定植潜能的分离株，为今后研究细菌宿主适应与定植机制提供了实用框架。