《Scientific Reports》：Anticancer activity and molecular docking of active ingredients from ethanolic extract of grapefruit peels against HepG2 cell
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天然产物是药物发现的重要来源，与合成化学品相比具有更大的结构多样性。天然产物在历史上为生物活性分子的鉴定做出了贡献，并在新治疗药物的发现中继续发挥关键作用。柑橘属（Rutaceae）植物是全球最重要的果树作物之一，2010年全球产量约为1.23亿吨。研究人员收
天然产物是药物发现的重要来源，与合成化学品相比具有更大的结构多样性。天然产物在历史上为生物活性分子的鉴定做出了贡献，并在新治疗药物的发现中继续发挥关键作用。柑橘属（Rutaceae）植物是全球最重要的果树作物之一，2010年全球产量约为1.23亿吨。研究人员收集葡萄柚皮，干燥后用70%乙醇提取其活性成分，并对所得提取物进行植物化学筛选。采用MTT法（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法）评估提取物的抗癌活性，检测细胞活力并确定IC??（半数抑制浓度）值。对具有前景的组分进一步采用高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）进行分析。结果显示，植物化学筛选表明酚类和黄酮类含量较高，其中柚皮苷（naringenin）为最丰富的化合物，其次是绿原酸（chlorogenic acid）和阿魏酸（ferulic acid）。该提取物对HepG2细胞表现出显著的抗癌活性，IC??为230.63 ± 1.61 μg/ml。针对甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）（PDB ID: 7YIM）对十六种植物化学物质进行分子对接分析，鉴定出多种与预测活性位点具有强结合亲和力的化合物。鞣花酸（ellagic acid）表现出最高的结合亲和力（-8.9 kcal/mol），其次是芦丁（rutin）（-8.8 kcal/mol）、槲皮素（quercetin）（-8.5 kcal/mol）和柚皮苷（-8.4 kcal/mol）。相互作用分析揭示了与关键AFP残基（包括LYS228、CYS224、PHE172、GLU489和MET490）的多种氢键和π-相互作用。这些发现突显了多酚类化合物，特别是鞣花酸和芦丁，作为AFP靶向抗肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）治疗的有前景的先导分子。葡萄柚皮提取物表现出有前景的抗氧化和抗癌活性，对HepG2细胞表现出浓度依赖性细胞毒性。尽管与多柔比星（doxorubicin）相比其效力较低，但它代表了生物活性化合物的宝贵天然来源。需要进一步研究以阐明其作用机制、安全性及在肝细胞癌治疗中的潜在应用。
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）占所有原发性肝癌的90%以上，是全球第六大常见癌症，在肝炎高流行地区（如埃及）具有显著的死亡率，是男性癌症死亡的第二大原因。主要风险因素包括病毒性肝炎（乙型和丙型肝炎）、酒精性肝病以及非酒精性脂肪性肝炎/非酒精性脂肪性肝病。埃及丙型肝炎病毒（HCV）传播率较高，每年约有416,000例新发病例，且HCV与HCC进展存在关联。2018年全球癌症观察站数据显示，肝癌占所有年龄段和性别新诊断病例的19%，发病率为32%，死亡率为31%。在此背景下，从天然产物中寻找具有抗癌活性的新型治疗药物成为研究热点。
葡萄柚（Citrus × paradisi）属于芸香科（Rutaceae）柑橘属，是全球重要的果树作物。柑橘类水果富含生物活性化合物，包括黄酮类、酚类等，这些成分主要集中在果皮、白皮层（albedo）中。柚皮苷作为葡萄柚的主要黄酮类成分，已被报道具有显著的抗血管生成和化学预防特性，能够通过诱导凋亡、下调关键生长因子（如转化生长因子-β（TGF-β）和血管内皮生长因子（VEGF））以及调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路来发挥抗肝细胞癌作用。基于此背景，研究人员开展了本项研究，旨在评估葡萄柚皮乙醇提取物对HepG2细胞的抗癌活性，利用HPLC分析鉴定其主要生物活性成分，并通过计算机模拟对接研究探究其与甲胎蛋白（AFP）的潜在分子相互作用，为开发AFP靶向的HCC治疗策略提供理论基础。该研究成果发表在《Scientific Reports》。
本研究采用的主要关键技术方法包括：植物样本于2023年春季采集自埃及开罗当地市场，经干燥、粉碎后以70%乙醇提取；采用MTT法评估提取物对HepG2细胞的细胞毒性并计算IC??值；利用高效液相色谱法（HPLC，Agilent 1260系统，C18柱）对活性成分进行定性与定量分析；通过AutoDock 4.2和PyRx/AutoDock Vina进行分子对接研究，以AFP蛋白（PDB ID: 7YIM）为靶点，利用PrankWeb服务器预测活性结合位点，并在Discovery Studio Visualizer中分析蛋白-配体相互作用模式。
**植物化学筛选结果**：定性植物化学筛选显示，葡萄柚皮乙醇提取物中检测到酚类、黄酮类和脂肪酸等成分，未检测到生物碱、糖苷、花青素、香豆素、还原糖、淀粉、蛋白质和氨基酸等其他类别化合物。总酚含量为867 ppm，总黄酮含量为340 ppm，儿茶素含量为81.8 ppm，抗坏血酸含量为55.6 μg/g。叶绿素和类胡萝卜素分析表明，叶绿素b含量（0.051 mg/g）高于叶绿素a（0.028 mg/g），总类胡萝卜素含量（0.072 mg/g）高于总叶绿素含量。
**HepG2细胞活力与抗癌活性**：MTT法检测结果表明，葡萄柚皮乙醇提取物对HepG2细胞具有显著的浓度依赖性细胞毒性作用。在最高测试浓度1000 μg/mL时，细胞活力降至2.87%，细胞毒性达97.13%。随着浓度降低，细胞毒性逐渐减弱，呈现出明确的剂量-效应关系。提取物IC??为230.63 ± 1.61 μg/mL，而阳性对照药物多柔比星的IC??为20.09 ± 2.54 μg/mL，显示出更强的细胞毒性。
**薄层层析（TLC）分析**：TLC色谱分析显示，葡萄柚皮提取物中各组分分离良好，经DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）试剂喷雾后呈现黄色或白色斑点对抗紫色背景，表明具有良好的抗氧化活性。
**HPLC活性成分鉴定**：HPLC分析共鉴定出16种化合物，其中柚皮苷浓度最高，达1444.62 μg/mL；其次是绿原酸（101.35 μg/mL）和阿魏酸（86.66 μg/mL）。其他含量较低的成分包括没食子酸（29.79 μg/mL）、香草醛（0.95 μg/mL）、槲皮素（0.88 μg/mL）、芹菜素（0.58 μg/mL）、咖啡酸（0.28 μg/mL）和肉桂酸（0.10 μg/mL）等。
**分子对接结果**：PrankWeb分析确定了AFP蛋白（7YIM）中一个定义良好的结合腔，关键残基包括LYS A:228、PHE A:172、CYS A:224、ALA A:225、GLU A:489和MET A:490等。十六种植物化学物质的分子对接结果显示，结合亲和力范围为-5.5 kcal/mol（香草醛）至-8.9 kcal/mol（鞣花酸）。鞣花酸以-8.9 kcal/mol的结合亲和力成为最强结合分子，其平面多环芳香结构和四个羟基使其能够形成多重氢键和π-堆积相互作用。芦丁以-8.8 kcal/mol紧随其后，尽管分子较大，其糖基部分与结合位点边缘极性残基的额外相互作用补偿了柔性分子结合的熵损失。槲皮素（-8.5 kcal/mol）和柚皮苷（-8.4 kcal/mol）也表现出良好的结合能力。相比之下，简单酚酸类如香草醛（-5.5 kcal/mol）、丁香酸（-5.6 kcal/mol）、甲基没食子酯（-6.0 kcal/mol）和对香豆酸（-6.0 kcal/mol）的结合亲和力明显较低，这归因于其分子体积较小、氢键供受体数量有限以及缺乏π-堆积所需的扩展芳香表面。
**蛋白-配体相互作用分析**：Discovery Studio Visualizer分析显示，高亲和力化合物在AFP结合口袋中利用特征性的相互作用模式。鞣花酸与关键残基形成多重常规氢键，其芳香环系统与PHE A:172发生π-π堆积相互作用，与LYS A:228形成π-阳离子相互作用，同时与MET A:490和ALA A:225存在疏水接触。槲皮素和芹菜素作为黄酮类化合物，显示出与鞣花酸相似的相互作用模式，包括PHE A:172的保守π-堆积和与极性残基的氢键结合。芦丁的糖基部分向结合位点溶剂暴露边缘延伸，建立了额外的极性接触，解释了其高结合亲和力。
讨论部分指出，葡萄柚皮提取物的细胞毒性作用可归因于其高含量的生物活性植物化学物质，特别是黄酮类、酚类化合物和柠檬苦素类。这些成分通过激活线粒体途径（包括上调促凋亡蛋白和下调抗凋亡蛋白）诱导凋亡，增强活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）生成导致氧化应激和线粒体功能障碍，并通过调节PI3K/Akt和MAPK等关键信号通路诱导细胞周期阻滞。此外，提取物还可能抑制血管生成和转移潜能。
研究同时指出本研究的局限性：仅采用HepG2细胞系的体外实验设计无法完全反映体内生物系统的复杂性；缺乏体内动物模型验证和临床证据来确认其安全性、生物利用度和治疗有效性。未来研究建议包括体内研究、机制评价、药代动力学和毒性分析，以支持其作为天然抗癌剂的潜在开发。
结论部分总结道：葡萄柚皮乙醇提取物含有多种生物活性化合物，可作为抗氧化剂具有高自由基清除活性和抗癌活性。HPLC结果显示柚皮苷在葡萄柚皮中浓度较高，分子对接研究确定鞣花酸、芦丁、槲皮素和柚皮苷为最有前景的AFP抑制剂，其中鞣花酸和芦丁作为AFP靶向治疗肝细胞癌的潜在先导化合物。然而，需要进一步的实验验证，包括体外、体内和分子动力学研究，以确认其治疗效力和结合稳定性。因此可以得出结论，葡萄柚皮具有治疗价值，可作为抗肝细胞癌的有前景的天然药物。但该研究建议通过体内实验（使用实验动物）更准确地评估植物的有效性、安全性和毒性。
