通过连续传代iPSC来源的NPC球体生成功能性少突胶质细胞祖细胞

《Cells》：Generation of Functional Oligodendrocyte Progenitor Cells Through Serial Replating of iPSC-Derived NPC Spheres

　　

少突胶质细胞（OLs）对中枢神经系统的髓鞘形成至关重要，其缺失或功能紊乱是多种脱髓鞘和神经退行性疾病的标志。尽管少突胶质细胞前体细胞（OPCs）代表了髓鞘再生治疗的一种有前景的细胞来源，但现有从人诱导多能干细胞（iPSCs）生成OPCs的方案通常受限于培养周期长、效率低和细胞异质性。在此，研究人员报告了一个高效且可重复的平台，通过发育信号通路的阶段特异性调控，从iPSC来源的神经祖细胞（iNPCs）生成OPCs。与常规方法相比，iNPCs的定向分化重现了关键的发育转变，在显著缩短的时间内从OLIG2⁺/NKX2.2⁺祖细胞进展为CD140a⁺/O4⁺ OPCs。值得注意的是，iNPC来源的球体起到了祖细胞样微环境的作用，通过连续传代实现了持续的OPC产生。纯化的OPCs可分化为MBP⁺少突胶质细胞，并在体外通过纳米纤维包绕以及在体内移植至shiverer（shi/shi）小鼠后展现出髓鞘形成能力，在宿主轴突周围形成髓鞘。尽管取得了这些进展，但OPC分化和成熟效率仍不理想，突显了进一步优化的必要性。总体而言，研究人员的发现建立了一种可规模化且时间高效的iPSC来源OPC生成策略，并强调了其在疾病模型和基于细胞的髓鞘再生治疗中的潜力。

**研究背景、问题与意义：**

少突胶质细胞（OLs）是中枢神经系统中负责髓鞘形成和维持的特化胶质细胞，其丧失或功能障碍是多种脱髓鞘疾病（如多发性硬化、脑白质营养不良）及神经退行性疾病的标志。虽然少突胶质细胞前体细胞（OPCs）因其迁移能力、能够在宿主中枢神经系统中整合并包裹轴突而成为髓鞘再生治疗的有希望的候选细胞，但现有从人诱导多能干细胞（iPSCs）生成OPCs的方案普遍存在培养周期过长（通常需要75–150天）、效率低下及细胞异质性等问题。尽管转录因子驱动策略显著加快了谱系特化，但随机基因组整合带来的安全风险限制了其转化潜力。因此，迫切需要一种安全、明确且时间高效的策略来获得高纯度的功能性OPCs。本研究旨在通过阶段特异性调控发育信号通路，建立一种从iPSC来源的神经祖细胞（iNPCs）高效生成OPCs的可重复平台，并验证其体内外髓鞘形成能力。论文发表在《Cells》。

**主要关键技术方法（≤250字）：**

研究人员利用CRL-2097新生儿皮肤成纤维细胞重编程获得人iPSCs，通过阶段特异性小分子组合（包括抑制TGF-β/BMP通路、激活SHH通路及Wnt通路）将iPSCs定向诱导为神经祖细胞（iNPCs）。随后，在添加视黄酸（RA）和SAG（SHH通路激动剂）的培养基中培养iNPCs，使其形成表达OLIG2⁺/NKX2.2⁺的神经上皮样细胞球体；再撤除RA/SAG，加入PDGF-AA、HGF、IGF1、NT3等促有丝分裂因子，促进OPCs的扩增与成熟。通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化CD140a⁺/O4⁺ OPC群体。体内移植采用免疫缺陷的shiverer小鼠（shi/shi × rag2^-/-）。

**研究结果（保留各小标题）：**

**3.1 通过阶段特异性信号调控生成iPSC来源的NPCs：** 研究人员通过阶段特异性小分子处理，将iPSCs依次形成拟胚体（EBs）并诱导为贴壁的单层iNPCs。qPCR和免疫荧光证实iNPCs高表达PAX6、SOX1、SOX2、NESTIN等神经祖细胞标志物，且不表达多能性基因（如OCT4、NANOG）。这些iNPCs在长期培养（至20代）中维持稳定增殖和分子特征。

**3.2 定义iNPCs的细胞和分子特征：** 通过qPCR和免疫荧光分析，iNPCs显著下调多能性基因，上调NPC相关基因。免疫荧光显示OCT4、SSEA4、TRA1-60、NANOG在iPSCs中强表达而在iNPCs中消失；PAX6、SOX1、NESTIN在iNPCs中高表达。iNPCs在连续传代（p7–p20）中NPC标志物表达稳定，累积细胞计数显示其可扩增超过30天。

**3.3 评估iNPCs的体外分化潜能：** 将iNPCs在无有丝分裂原培养基中自发分化30天，观察到神经元样和胶质样形态。免疫荧光显示TUBB3⁺和MAP2⁺神经元约占40%，GFAP⁺和S100B⁺星形胶质细胞分别占2.9%和4.2%，OLIG2⁺细胞占4.5%，但未检测到MBP⁺成熟少突胶质细胞。表明iNPCs具有多能性，但自发分化不足以产生成熟OLs。

**3.4 使用发育信号线索从iNPCs生成OPCs：** 通过添加RA和SAG处理，在第4天诱导出OLIG2⁺/NKX2.2⁺细胞（约10%双阳性）。随后撤除RA/SAG，加入PDGF-AA、HGF、IGF1、NT3等因子，球体周围在第24天出现伸出分支的细胞并向外迁移增殖。至第48天，免疫荧光和qPCR检测到O4、PDGFRα、SOX10、OLIG2、NG2、NKX2.2等OPC标志物阳性细胞，但同时也存在GFAP⁺星形胶质细胞（8.5%）和MAP2⁺神经元（32.7%），表明培养物异质性。

**3.5 球体的连续传代维持OPC产生但自我更新能力有限：** 研究人员发现球体核心似祖细胞微环境，可将球体机械转移至新培养皿中继续产生OPCs。第一次和第二次传代后，出芽细胞中NKX2.2（64.4%和62%）、OLIG2（74.9%和80.5%）、O4（67.4%和55%）、PDGFRα（49.9%和44.3%）阳性比例较高。但第三次传代后CD140a⁺/O4⁺比例显著下降。累积产量显示每9.4 cm2可获得约1×10⁶个纯化OPCs。

**3.6 OPCs在体内外分化为髓鞘形成少突胶质细胞：** FACS分选的CD140a⁺、O4⁺或双阳性细胞经T3诱导5天后出现多分支成熟少突胶质细胞形态，约15%表达MBP（CD140a⁺组14.3%；双阳性组14.1%；O4⁺组6.7%）。与纳米纤维共培养后，MBP⁺/PLP1⁺细胞包裹纤维，表明髓鞘形成能力。在体内，将未分选的第48天细胞移植至新生shiverer小鼠（shi/shi × rag2^-/-）脑内（10周后），人核（hN）阳性供体细胞主要分布于脑干和小脑白质，15.4%的hN⁺细胞表达MBP。MBP⁺节段与宿主轴突标记NF和TUBB3共定位，形成包裹。电镜观察显示在纹状体区域出现致密多层髓鞘。

**讨论与结论总结：**

讨论部分指出，尽管本研究建立的iNPCs稳定增殖且表达典型NPC标志物，但其精确区域身份和体内功能等效性仍需进一步通过区域特异性模式信号和转录组分析来明确。在OPC生成中，虽然通过模拟发育信号显著缩短了时间，但培养物仍存在异质性，需优化小分子组合或采用瞬时非整合转录调控以提高谱系特异性。球体连续传代可作为祖细胞微环境，但自我更新能力有限，未来可通过调控微环境信号或工程化三维环境来增强持续性。OPC终末分化效率低（仅约15%MBP阳性），提示当前条件不足以支持同步高效成熟。体内移植后供体细胞主要分布在白质区域并分化为少突胶质细胞（表达MBP、PLP1、MOG、MAG、SOX10），但未详细分析其他谱系分化，且仅有一个时间点数据，长期安全性和功能性整合尚需评估。总体而言，该平台为疾病模型和细胞治疗提供了可规模化的基础，但需进一步优化分化、扩增和成熟条件。

**结论翻译：** 总之，研究人员建立了一个可重复且时间高效的系统，通过连续传代策略从iPSC来源的NPCs生成人OPCs。这些OPCs分化为MBP⁺少突胶质细胞，在体外包裹纳米纤维，在体内包裹轴突，并在移植的脑中形成致密髓鞘。该方法提供了一个可规模化平台，通过持续改进，不仅有望用于疾病模型和药物筛选，还可能成为针对脱髓鞘疾病的细胞治疗的基础。