全脑连接组鉴定PMvLepRb神经元作为下丘脑枢纽连接代谢状态与本能行为

《Cells》：Whole-Brain Connectome Identifies PMvLepRb Neurons as a Hypothalamic Hub Linking Metabolic State to Instinctive Behavior

　　

代谢状态强烈影响社交与生殖行为，但将内源性能量信号转化为行为反应的神经环路尚不清楚。下丘脑腹侧前乳头体核(premammillary nucleus, ventral part, PMv)被认为参与该过程，尤其是通过其瘦素受体(leptin receptor, LepRb)表达神经元，但其全脑环路构型仍不明确。本研究在LepRb-Cre小鼠中采用Cre依赖的逆行(rabies virus, RV)及顺行(herpes simplex virus, HSV)病毒示踪技术，构建了PMvLepRb神经元单细胞分辨率的输入-输出图谱。三维重建显示，这些神经元接受密集汇聚性输入，主要来自参与能量平衡、动机及边缘处理的下丘脑和前脑区域；而其输出不仅回馈部分输入区，还显著投射至中脑及脑桥自主神经中枢，包括导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)和臂旁核(parabrachial nucleus, PB)。定量分析表明，前脑区域多参与交互性连接，而脑干区域以传出投射为主。该组织结构提示PMvLepRb神经元可整合代谢与动机信号，并将其传递至控制本能行为及自主反应的下游系统。研究结果为了解能量状态如何影响与社会竞争和生殖相关的行为决策提供了结构基础。

论文解读：全脑连接组鉴定PMv^LepRb神经元作为下丘脑枢纽连接代谢状态与本能行为

研究背景与目的

动物需根据内部生理需求（如能量储备）和环境条件调整行为，饥饿、能量储备、社会竞争及生殖机会共同塑造生存所需的行为决策。雄性动物的领地防御、优势竞争及求偶行为能耗高且具风险，因此须受机体能量状态的严格调控。生理学经典观点认为大脑存在神经内分泌"门控(gating)"机制：能量不足时抑制耗能的社交与生殖行为，能量充足时允许之，但其神经基础未明。下丘脑(hypothalamus)协调稳态调节与动机行为，其中腹侧前乳头体核(PMv)被认为是连接代谢信号与社交及生殖功能的关键节点，解剖与功能研究显示PMv与多个下丘脑及边缘区相连，参与信息素处理、青春期发育、生殖轴调节及雄性社交行为。但PMv含异质性神经元群体，需明确特定亚型环路。瘦素(leptin)为脂肪源激素，反映机体能量储存，是能量稳态关键调节因子；PMv是下丘脑中瘦素受体(LepRb)高表达区之一，PMv^LepRb神经元主要为Vglut2阳性兴奋性神经元并对瘦素有反应，既往研究提示其参与青春期启动、促性腺调节及能量平衡。然而PMv^LepRb神经元在全脑环路中的嵌入方式仍不清楚，早期解剖研究仅粗略描述PMv连接且无法区分细胞类型特异性输入/输出通路，亦不清楚其如何整合上游多样信号并中继至驱动行为的下游结构。本研究旨在利用Cre依赖的单突触病毒示踪绘制LepRb-Cre小鼠中PMv^LepRb神经元的全脑输入-输出架构，识别传递代谢与社会信息的主要上游源及介导行为与生理反应的下游靶区，阐明其连接组织原则，为理解代谢信号如何经此影响社交与生殖行为提供结构框架。本文发表于《Cells》。

主要关键技术方法

研究人员选用16只雄性LepRb-Cre小鼠（Jackson Laboratory, stock #008320），最终质控合格纳入10只（逆行狂犬病病毒示踪组n=5，顺行单纯疱疹病毒示踪组n=5）。采用Cre依赖的单突触逆行示踪系统——辅助AAV（AAV-EF1α-DIO-TVA-EGFP + AAV-EF1α-DIO-RG）注入PMv后两周，再注射RV-EnvA-ΔG-mCherry标记上游单突触输入神经元；同时采用Cre依赖严格顺行单突触示踪系统——辅助AAV（AAV-hSyn-DIO-mCherry-Her2CT9 + AAV-UL26.5-DIO-cmgD）注入PMv后两周，再注射H.129-ΔgD-hUbC-EGFP-scHer2::gD标记下游单突触输出神经元。灌注取脑后行免疫荧光染色，全脑连续冠状切片经QuPath结合Cellpose进行胞体自动分割并经人工校正，利用ABBA插件将图像非线性配准至艾伦小鼠脑公共坐标框架(Allen CCFv3)，获得标记神经元三维坐标，用Python及brainrender构建全脑点云，按CCFv3分区统计绝对细胞数并做log₁₀(x+1)转换及Z-score标准化，依阈值划分四连通模块，用Mann–Whitney U检验及层次聚类分析连接模式。

研究结果

3.1. Viral Tracing Strategies for Mapping the Brain-Wide Inputs and Outputs of PMv^LepRbNeurons（PMv^LepRb神经元全脑输入与输出病毒示踪策略验证）

研究人员分别在LepRb-Cre小鼠PMv注射辅助AAV后两周注射RV（逆行）或HSV（顺行），组织学验证显示辅助病毒与示踪病毒在PMv内高度共定位，双标细胞为起始神经元(starter neurons)，仅mCherry标记为逆行单突触输入神经元，仅EGFP标记为顺行单突触输出神经元，三维空间重建确认起始神经元及标记神经元在PMv内的离散分布，证实两套病毒示踪体系可准确可靠地用于后续全脑连接组分析。

3.2. Global Architecture of the PMv^LepRbAfferent and Efferent Networks（PMv^LepRb传入与传出网络的整体架构）

分析五只动物全脑切片中RV标记输入神经元与HSV标记输出神经元分布并行三维重建，发现输入主要源自下丘脑(HY, 62.13%)，次为纹状体(STR, 11.77%)、苍白球(PAL, 11.12%)及皮层下板(CTXsp, 5.7%)，具体密集输入核团含终板血管器(MPo)、内侧视前核(MPN)、腹内侧下丘脑(VMH)、弓状核(ARH)、终纹床核(BST)、外侧隔核(LSv/LSr)、内侧杏仁核(MEA)及海马CA1等共176个脑区。输出仍以下丘脑为主要靶区(45.28%)，但明显不同处在于PMv^LepRb神经元向中脑(MB, 13.58%)及脑桥(P, 5.9%)发出密集下行投射——尤其至导水管周围灰质(PAG)、中缝核(MRN)及臂旁核(PB)——而这些脑干区几无逆向输入。下丘脑内输出靶区含外侧下丘脑区(LHA)、前下丘脑核(AHN)、背内侧下丘脑(DMH)及BST、MEA、外侧隔核等共223个靶区。结果表明PMv^LepRb神经元呈不对称连接组特征：整合前脑与下丘脑主导输入并形成局部交互连接，同时将多样信号中继至中脑和脑干部位自主神经中枢。

3.3. Quantitative Profiling of Brain-Wide Afferent and Efferent Nuclei of PMv^LepRbNeurons（PMv^LepRb神经元全脑传入与传出核团的定量剖析）

对标注神经元计数并按占总连接比例排序，最强输入源为BST(9.3%)、MPN(8.6%)、PMv局部微环路(6.9%)、PVp(5.1%)、ARH(4.2%)、MPo(4.1%)、DMH(3.6%)、TU(3.3%)、AHN(2.9%)等；最强输出靶为MEA(7.5%)、BST(4.7%)、AHN(5.9%)、LHA(3.9%)、MPN(3.7%)、PAG(5.1%)、MRN(2.5%)、PB(1.8%)等。经log转换与Z-score标准化，按阈值划为四象限模块：High-In/High-Out（高入高出，如BST、MEA、MPN，具强交互互惠性）、High-In/Low-Out（高入低出，如室旁下丘脑核PVH，主要提供输入）、Low-In/High-Out（低入高出，如PAG、MRN、PB，为典型下行靶区几乎无逆向反馈）、Low-In/Low-Out。统计检验证实不对称模块出入差异显著(p<0.01或p<0.0001)，高入高出模块出入无显著差异(ns)，层次聚类热图显示各动物间一致性良好。该定量模块化分析揭示PMv^LepRb连接非随机分布且具有明确输入输出分化。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究首次绘制了PMv^LepRb神经元全脑单突触输入-输出连接组。PMv^LepRb神经元接受来自176个脑区（主要为下丘脑与边缘系统）的代谢（ARH、VMH、PVH、LHA）、社会/情感（MEA、LS、BST、CA1）及生殖调控（MPo、MPN）等多模态信息输入，使其结构定位于代谢、社会及生殖通路的解剖汇聚点。其输出网络具显著不对称性——在下丘脑形成反馈调节，在前脑边缘核团具交互性，并向含PAG、MRN、PB在内的脑干自主神经中枢发出强下行投射而无明显逆向反馈，为代谢状态可自上而下调制本能行为与生理反应（如社会竞争时的姿势调整、心肺动员）提供解剖底物。PMv^LepRb与VMH、MEA的连接可处理雄鼠种间社交信号，长程投射至PAG及PB可能分别参与等级关系相关的姿势调节及高强度对抗时的自主神经动员。能量充足时瘦素发挥允许效应使耗能社交/生殖行为得以启动；能量匮乏时PMv兴奋性降低使动物放弃非必需争斗与求偶以避免致命能耗耗竭。作者也指出本研究局限：仅使用雄性小鼠未探讨性别差异，病毒示踪仅证形态连接非功能连接，静态图谱不能确立因果行为驱动关系，未来需结合光遗传与电生理、在雌鼠中绘制连接组、细分投射亚型及在代谢病模型中探究变化。

结论（翻译）

本研究首次提供了PMv^LepRb神经元全面的全脑输入-输出图谱。数据显示此类神经元整合编码代谢、社交、情绪及生殖状态的多样化输入，继而对其上游传入区行使反馈调节，并向脑干发出强兴奋性传出投射。该图谱为阐明大脑如何将内部代谢状态与生存相关的本能行为相耦联提供了关键解剖基础。