骨骼肌NOX4水平下降消除运动诱导的适应性稳态并加剧生物衰老

《SCIENCE ADVANCES》：A decline in skeletal muscle NOX4 abrogates exercise-induced adaptive homeostasis and exacerbates biological aging

　　

核因子红细胞2相关因子2（NFE2L2/Nrf2）调控的适应性稳态（adaptive homeostasis）受损及氧化应激被认为系衰老的关键特征。收缩骨骼肌中活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生酶NADPH氧化酶4（NOX4）是NFE2L2适应性稳态的强效诱导因子。本研究报道，小鼠及人类骨骼肌NOX4水平随增龄下降，导致NFE2L2适应性稳态丧失、蛋白质氧化损伤增加及肌肉功能减退。研究人员发现，骨骼肌特异性敲除NOX4加剧衰老相关的生理衰退，引发明显肌少症（sarcopenia）和衰弱（frailty），其特征为身体活动减少、脂肪量增加、全身炎症、全身胰岛素抵抗及普通饲料喂养老年小鼠并发晚期肝病。老年骨骼肌NOX4缺陷小鼠的系统性生理衰退可通过病毒载体恢复NOX4，或用莱菔硫烷（sulforaphane）激活下游NFE2L2并重建本应由运动诱导的适应性稳态反应而纠正。本研究结果为年龄增长伴体力活动减少所致NFE2L2调控适应性稳态下降的机制提供了重要见解，并阐明运动促进健康衰老的关键机制。

《SCIENCE ADVANCES》刊发研究解读：骨骼肌NOX4缺失致适应性稳态受损与衰老加速的机制研究

一、研究背景与立项依据

衰老过程中，核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2–related factor 2, NFE2L2/Nrf2）介导的适应性稳态（adaptive homeostasis）逐渐衰退，活性氧（reactive oxygen species, ROS）导致的氧化损伤累积，被认为是驱动机体老化的重要机制。收缩状态下的骨骼肌是ROS的重要来源，也是运动诱导NFE2L2适应性稳态——包括抗氧化防御、线粒体生物发生（mitochondrial biogenesis）、葡萄糖摄取及胰岛素敏感性提升——的核心器官。NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4, NOX4）定位于肌质网、横管及线粒体内膜，可在肌肉收缩时被诱导表达并直接产生H₂O₂，通过氧化KEAP-1（Kelch-like ECH-associated protein-1）/Cullin-3 E3连接酶复合体中Cys残基，促使NFE2L2释放入核，启动抗氧化酶及PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha）等靶基因转录。既往研究表明，运动可上调骨骼肌NOX4并激活此通路，但增龄过程中NOX4是否下降、其下降是否为衰老相关NFE2L2功能受损及肌少症（sarcopenia）发生的因果环节尚不清楚。本研究旨在明确人及小鼠衰老过程中骨骼肌NOX4与NFE2L2通路的改变，通过肌肉特异性NOX4敲除小鼠模型验证其因果作用，并探索运动训练、AAV介导的NOX4回补及NFE2L2激动剂莱菔硫烷（sulforaphane, SFN）能否逆转相关表型。

二、主要关键技术方法

研究采用人股外侧肌RNA-seq数据集（GSE159217，青年vs老年男性）及匹配BMI的人体肌活检标本行免疫印迹与质谱线粒体蛋白分析；利用CRISPR-Cas9 RNP编辑人iPSC来源成肌细胞及永生化人成肌细胞系NOX4及KEAP1；构建肌酸激酶（muscle creatinine kinase, MCK）启动子驱动Cre重组酶剔除NOX4的肌肉特异性敲除小鼠（Mck-Cre;Nox4^fl/fl），以同窝Nox4^fl/fl为对照，给予标准饲料喂养至指定月龄；对12月龄小鼠行5周渐进式跑台运动训练；对21月龄小鼠尾静脉输注AAV9-MHCK7-mNox4重建肌肉NOX4表达，或腹腔注射sulforaphane（2 mg/kg，每周3次，4周）；检测指标涵盖腓肠肌qPCR与免疫印迹（NFE2L2靶基因、氧化蛋白羰基化/Oxyblot、线粒体复合物、Tomm20免疫荧光）、旷场与跑轮代谢笼监测、抓力与转棒（rotarod）运动功能、胰岛素耐量及高胰岛素-正血糖钳夹、血清生化（CK、ALT、AST、细胞因子ELISA）、肝脏组织学（H&E、Picrosirius red、纤维化基因qPCR）及骨骼肌bulk RNA-seq与生信富集分析。

三、研究结果

Human skeletal muscle NOX4 and NFE2L2 adaptive homeostasis decline during aging（人类骨骼肌NOX4与NFE2L2适应性稳态随增龄下降）

分析公共RNA-seq及人肌活检发现，老年人股外侧肌NFE2L2靶抗氧化基因（SOD2、PRDX1/3、GPX1、NQO1）显著下调，KEAP1/NFE2L2通路富集分数降低；虽NOX4 mRNA无差异，但NOX4蛋白水平显著下降，NOX2（CYBB）蛋白未降；伴随线粒体SOD2减少及蛋白羰基化（protein carbonylation）升高。人成肌细胞CRISPR删除NOX4后，NFE2L2核转位受阻，SOD2、PRDX3、GPX1、catalase下调，线粒体O₂^•?（MitoSOX）及蛋白羰基化增加，共删除KEAP1可挽救上述表型，证实肌肉细胞NOX4缺失细胞自主性导致NFE2L2适应性稳态丧失与氧化损伤。

Skeletal muscle NOX4 and NFE2L2 adaptive homeostasis decline during aging in mice（小鼠骨骼肌NOX4与NFE2L2适应性稳态随增龄下降）

C57BL/6小鼠腓肠肌中Nox4 mRNA及蛋白于12月龄始下降，20月龄进一步降低；同步出现Nfe2l2、Sod2、Nqo1、Prdx1/3等抗氧化基因表达与蛋白下调，蛋白羰基化随龄递增，印证小鼠模型重现人衰老骨骼肌分子表型。

NOX4 deficiency abrogates NFE2L2 adaptive responses and promotes sarcopenia with age（NOX4缺失消除NFE2L2适应性反应并促进增龄性肌少症）

Mck-Cre;Nox4^fl/fl小鼠喂饲至20月龄，体重因脂肪量（inguinal与附睾白色脂肪组织/WAT）增加而升高，瘦体重无差异；自愿跑轮活动与能耗下降。腓肠肌、股四头肌等重量较对照减轻，血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）升高；PGC-1α与氧化磷酸化（OXPHOS）复合物蛋白降低，SDH（succinate dehydrogenase）与Tomm20免疫荧光显示肌纤维线粒体内/肌膜下含量减少。运动耐力、抓力及转棒滞留时间显著差于对照；按Valencia标准计算的衰弱评分升高。腓肠肌RNA-seq显示NFE2L2通路、自噬/线粒体自噬（mitophagy）、PPAR与AMPK信号显著下调，炎性与衰老相关基因（Il6、Tnf、Ccl2、Gpnmb等）上调；SOD2、NQO1、catalase蛋白降低，蛋白羰基化加剧——证明骨骼肌NOX4缺失足以引起NFE2L2适应性稳态崩溃、线粒体内容减少、肌少症及衰弱提前发生。

NOX4 deficiency promotes systemic inflammation and metabolic disease（NOX4缺失促进全身炎症与代谢性疾病）

20月龄Mck-Cre;Nox4^fl/fl小鼠血清IL-6升高，空腹与餐后血糖及胰岛素升高，胰岛素耐量试验（ITT）与高胰岛素-正血糖钳夹示全身及肌肉胰岛素敏感性下降；肝重增加，组织学见大泡性脂变（steatosis）、炎性浸润、Picrosirius red染色胶原沉积，肝脂质合成基因（Fasn、Srebp1、Scd1）、TNF-α及纤维化标志（Acta2、Tgfb、Fn1、Col1a1）上调，羟脯氨酸含量与血清ALT、AST升高——表明肌肉NOX4缺失致局部炎症与氧化应激引发全身胰岛素抵抗并驱动代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）伴纤维化进展。

NOX4 is required for the adaptive responses to exercise that mitigate aging（运动延缓衰老的适应性反应依赖NOX4）

12月龄C57BL/6小鼠经5周跑台训练可使Nox4 mRNA/蛋白及Nfe2l2、Sod2、Nqo1恢复至6月龄水平，蛋白羰基化降低；同方案训练不能挽救Mck-Cre;Nox4^fl/fl小鼠NFE2L2靶基因诱导及运动能力提升，证实衰老相关的NOX4下降源于体力活动减少，且NOX4是运动诱导骨骼肌NFE2L2适应性稳态的必要条件。

NFE2L2 activation tempers aging in muscle NOX4-deficient mice（激活NFE2L2缓解肌肉NOX4缺陷小鼠的衰老表型）

21月龄Mck-Cre;Nox4^fl/fl小鼠给予sulforaphane 4周，腓肠肌NFE2L2、SOD2、catalase恢复，蛋白羰基化减少，Tomm20线粒体标记回升；肌肉质量回升、脂肪量下降、血清CK正常化；运动耐力与转棒改善；高血糖纠正，肝脏TNF-α及血清TNF/IL-6降低，肝脂变减轻，ALT/AST回降（已形成的胶原沉积无明显逆转）——说明NFE2L2激动剂可绕过NOX4缺陷重建适应性稳态，改善肌少症、代谢异常及早期肝损伤。

The restoration of NOX4 tempers the physiological decline with aging（恢复NOX4可缓解衰老生理衰退）

给21～22月龄C57BL/6野生型小鼠静脉注射AAV9-MHCK7-mNox4，骨骼肌及心肌Nox4过表达使腓肠肌Nfe2l2、Sod2、Nqo1、Pgc1a上调，Tomm20染色增强，肌肉质量增加，运动耐力与抓力改善，空腹血糖降低，ITT改善；在12月龄Mck-Cre;Nox4^fl/fl小鼠中AAV回补NOX4可使骨骼肌Nox4恢复至对照组水平，纠正抗氧化基因下调、蛋白羰基化、线粒体含量减少、肌力与胰岛素敏感性下降及血清CK升高——直接证明重建肌肉NOX4可逆转衰老相关的NFE2L2适应性稳态丧失及生理功能退化。

四、讨论与结论总结

讨论指出，运动的健康获益部分通过骨骼肌NOX4依赖性ROS/H₂O₂生成激活NFE2L2所介导；增龄性体力活动减少致NOX4下调，进而消除NFE2L2适应性稳态，引起抗氧化防御削弱、线粒体生物发生减少、蛋白氧化损伤累积、肌少症与衰弱及继发全身代谢紊乱。该过程具可逆性——运动训练可恢复野生型小鼠NOX4及NFE2L2反应，AAV介导的肌肉NOX4回补或NFE2L2激动剂sulforaphane可纠正NOX4缺陷老龄鼠的多重衰退表型。需注意NOX4在不同组织语境具双重性（如在压力超负荷心脏促肥大），但在生理性衰老骨骼肌中其诱导/回补具保护效应。

结论翻译：

本研究表明，骨骼肌NOX4是运动诱导有益适应性反应的关键介质，增龄过程中体力活动减少及NOX4水平下降会消除NFE2L2调控的适应性稳态，从而导致肌少症与衰弱的发展。研究揭示可通过肌肉NOX4重构或过继激活NFE2L2来纠正因不活动而受损的适应性稳态反应，为促进健康衰老提供了机制依据与潜在干预靶点。