培哚普利叔丁胺、苯磺酸氨氯地平与吲达帕胺固定剂量复方制剂的同时光谱光度测定多变量方法

《Analytica》：A Multivariate Approach to the Simultaneous Spectrophotometric Determination of Perindopril Erbumine, Amlodipine Besylate and Indapamide in Fixed-Dose Combination

　　

光谱光度法具有成本低、耗时少的优势，因此仍是一种具有吸引力的分析方法，尤其是与多变量校准模型联用时。该改进解决了紫外-可见（UV-VIS）光谱光度法的大多数缺陷，即复杂混合物的光谱缠绕问题。在本研究中，研究人员开发并验证了一种多变量模型，用于测定培哚普利叔丁胺（PER）、苯磺酸氨氯地平（AML）和吲达帕胺（IND），通过系统覆盖三种不同组分比例的固定剂量复方制剂，并达到了适用于含量测定要求的准确度，从而解决了此前未解决的挑战。实验方案采用三因素五水平的田口（Taguchi）正交阵列设计。为建立多变量校准模型，研究人员测试了主成分回归（PCR）、偏最小二乘（PLS）回归以及浓度残差增强最小二乘（CRACLS）回归算法。基于嵌套交叉验证（采用基于聚类的样本分割）估计的预测性能，选择遗传算法（GA）进行特征筛选并结合PCR作为最优模型。所开发的方法还评估了其环境友好潜力，分析方法验证程序确认了其对固定剂量药物复方制剂含量测定的适用性。

近年来，绿色与可持续分析化学理念日益受到重视，开发环境友好的药物质量控制方法成为分析化学领域的重要研究方向。紫外-可见（UV-VIS）光谱光度法相较于高效液相色谱法（HPLC）具有溶剂消耗少、废弃物产生量低、成本低、分析时间短以及整体环境可持续性高等优点，但药品作为复杂混合物，其光谱重叠问题不可避免地限制了光谱光度法的独立应用，使得HPLC仍是药物质量控制的金标准。随着计算机科学与统计学的发展，化学计量学方法尤其是多变量校准（MVC）显著拓展了光谱光度分析的应用范围。与传统单变量校准（UVC）不同，MVC利用多个波长处的吸光度值组合来降低干扰，实现复杂混合物的直接分析而无需预先分离。然而，多变量分析方法在药物复方制剂分析中仍面临诸多挑战：组分浓度比差异大、部分组分吸光度低、光谱高度重叠、以及小样本量构建模型时的过拟合风险等问题亟待解决。特别是在固定剂量复方制剂中，高浓度强吸光组分与低浓度弱吸光组分共存，使得准确量化尤为困难。此外，校准与验证数据的合理分割、浓度范围的科学选择等结构性策略仍缺乏系统研究。

针对上述问题，研究人员选择培哚普利叔丁胺（PER）、苯磺酸氨氯地平（AML）和吲达帕胺（IND）的固定剂量复方制剂作为代表性模型体系，开展了一项化学计量学辅助的UV-VIS光谱光度法研究。该体系具有组分浓度和吸光度差异大（高浓度强吸光的AML与低浓度弱吸光的PER在低波长区域）、光谱重叠显著等特征，且需覆盖三种不同组分比例的固定剂量复方制剂。研究旨在建立并验证一种同时定量测定该复方制剂中三种活性成分的方法，评估其定量性能、生态可接受性和可持续性，并提出改进的多变量校准开发与验证框架。

研究采用田口L₂₅正交阵列设计，三因素（PER、AML、IND浓度）五水平构建实验方案；溶剂筛选借助GreenSOL支持工具，基于分配系数（logP）、生产/使用/废弃物综合评分进行多层次筛选，最终确定为乙醇-水（50:50，v/v）混合体系。数据采集使用Thermo Scientific? Evolution 300光谱光度计，扫描参数为带宽1.5 nm、扫描速度240 nm min^-1、数据间隔1 nm。建模算法涵盖PLS回归、CRACLS和PCR，信号预处理方法包括均值中心化、Savitzky-Golay平滑、小波去噪、导数光谱、正交信号校正（OSC）、标准正态变量变换（SNV）和乘法散射校正（MSC）等。特征选择采用遗传算法（GA），配置种群规模150、进化40代、锦标赛选择规模5、单点交叉及自适应变异率、保留10个精英个体。模型性能评估采用基于K-means聚类的嵌套交叉验证策略，外层通过5次不同随机种子的聚类分割确保测试集代表性，内层采用重复10折交叉验证优化超参数，以测试集均方根误差（RMSE）作为无偏性能估计指标。绿色度评估采用AGREE指标。

溶剂选择结果表明，尽管水具有低紫外截止波长和良好环境特性，但因IND溶解度不足而被排除；乙腈虽光谱适用，但环境安全特性不佳。经GreenSOL工具筛选，乙醇因生产和使用评分优良、且对PER、AML和IND具有良好溶解性而被选为最佳有机溶剂。研究发现，若校准溶液与工作溶液间乙醇含量不一致会显著降低预测性能，强调全过程溶剂组成一致性的重要性。浓度范围确定需平衡多重约束：保证所有组分信号高于噪声水平、总吸光度低于2.0的经验阈值、满足固定剂量复方制剂的组分比例要求（AML/IND为2.7:1、5.5:1、11.1:1，PER/IND为3.2:1），同时维持吸光度-浓度的线性关系。通过浓度归一化光谱的重合性评估，确定最终名义浓度为：IND 2 μg mL^-1，AML 5.5、11.1、22.2 μg mL^-1，PER 6.4 μg mL^-1，各组分浓度范围跨度为名义值的75%-125%。

数据分割策略评估显示，基于K-means质心的测试集选择较随机分割更能保证代表性。PCA三维得分图证实训练样本对实验域的全面均匀覆盖，测试样本分布于整个坐标空间。三种算法比较中，PCR展现出最优泛化能力，PLS和CRACLS的训练集RMSE与测试集RMSE差距显著，提示存在过拟合。CRACLS虽能精确恢复分析物光谱形状且具有预测时增量的优势，但PCR整体更优。主成分数选择方面，前三个主成分显著，交叉验证确定七主成分时RMSE达平台期；该数目超过分析物数目，表明光谱数据中存在其他方差来源（仪器噪声、低浓度非 ideal 线性偏差、溶剂组成及温度微小变化等）。信号预处理筛选显示，MSC、SNV和OSC显著恶化模型性能，标准化轻微增加误差，均值中心化、一阶导数、小波去噪（二级分解软阈值）和Savitzky-Golay平滑（窗口7）改善有限，其中Savitzky-Golay平滑最优。GA特征选择进一步改善预测性能，从不同光谱区域选出80个波长点，对应IND的203 nm和270-290 nm特征吸收带、AML的310-390 nm特征吸收带，以及PER的吸收增长区和最大吸收区，验证了GA设置的合理性。模型残差相对于各分析物浓度无显著趋势和异方差性，Hotelling's T²与Q残差图显示仅一个样本（所有分析物最低浓度的校准样本）略超Q残差95%置信限，故未剔除任何样本。

方法验证遵照ICH Q2要求，选择性通过空白辅料光谱确认其在选定波长处吸收可忽略；准确度在80%、100%、120%三个水平测试，平均回收率均在98%-102%范围内，相对标准偏差（RSD）多低于1.0%。检测限（LOQ）以校准残差标准差计算，PER、AML、IND分别为0.89、1.14、0.22 μg mL^-1，所有校准浓度均高于LOQ。重复性RSD分别为0.62%、0.14%、0.48%，中间精密度RSD分别为1.50%、1.20%、0.58%，均达可接受标准。稳健性测试采用Plackett-Burman设计评估乙醇含量、溶剂纯度、超声提取时间、滤膜类型（尼龙与PTFE）和波长变异的影响，结果显示波长偏移对所有分析物预测浓度影响最显著，PER还对乙醇含量变化敏感，其余因素不显著，说明所选滤膜、溶剂纯度和超声时间可接受。

绿色度评估采用AGREE方法，样品前处理、设备定位和废弃物产生环节因离线操作得分较高，但无需提取或衍生化、使用乙醇和水且体积低于20 mL降低了整体影响，AGREE总得分为0.76，表明方法具有良好的环境性能。

研究结论部分指出，在全球日益重视绿色和可持续实践的背景下，分析科学应积极贡献于此。本研究成功开发并验证了一种环境可持续的UV-VIS光谱光度法，使用生态友好型溶剂，实现了固定剂量复方制剂中PER、AML和IND的同时测定，AGREEN得分为0.76。GA特征选择与信号预处理后PCR的结合获得了卓越的预测性能（RMSE 0.0725），优于其他评估模型。所提出的建模与验证框架有效解决了多变量校准中小样本数据集的挑战。未来工作应聚焦于降低样品制备的不确定性、严格的方法验证、建立控制策略、开发用户友好软件，以及采用生命周期评估方法进行更全面的可持续性评估，以确定实验工作量与模型选择偏倚之间的最佳平衡，制定稳健且普遍适用的模型评估指南，促进所提出分析策略在药物质量控制中的广泛应用。