探究文化遗产保护新方法：阿尔罕布拉宫与赫内拉利费（西班牙格拉纳达）装饰性喷泉中杀藻细菌的分离与特性分析

《Conservation》：Exploring New Conservation Methods: Isolation and Characterization of Algicidal Bacteria from Ornamental Fountains in the Alhambra and Generalife (Granada, Spain)

　　

阿尔罕布拉宫与赫内拉利费（西班牙格拉纳达）的装饰性喷泉构成了复杂的社会-生态水文系统（socio-ecological system），其中水体、石材与生物群落相互作用，使其对光合微生物（包括蓝藻、绿藻和硅藻）引起的生物风化（biodeterioration）高度敏感。常规化学杀菌剂尽管应用广泛，但存在毒性、材料降解、生态失衡及长期效果有限等显著缺陷。在此背景下，本研究评估了杀藻细菌（algicidal bacteria）作为控制文化遗产环境中光合生物生长的可持续替代方案的潜力。研究人员对八处装饰性喷泉的水样进行了16S核糖体核糖核酸（16S ribosomal ribonucleic acid, 16S rRNA）基因测序分析，以表征细菌群落并识别先前报道具有杀藻活性的分类群。研究人员进行了统计学分析以评估微生物群落结构与生物膜发育之间的关系。同时，研究人员采用过滤后的喷泉水样对小球藻（Chlorella vulgaris）进行功能筛选实验，以评估其内在抑制能力。选择活性最强的样本进行细菌分离，并通过共培养实验、细胞密度测定和脉冲振幅调制（pulse-amplitude-modulated, PAM）荧光测定法进行进一步验证。研究共检测到18个具有报道杀藻能力的属，占所有样本微生物组的重要比例。然而，这些分类学指标与生物膜发育之间未发现显著关联，凸显了分类学组成与功能活性之间的解耦现象。活性最强的分离株被鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）LIG25菌株，该菌株导致光合效率迅速下降，并实现了超过98%的藻类生长抑制。这些发现表明，装饰性喷泉微生物组是本地生物防治因子的宝库，并为文化遗产保护领域生态友好型策略的开发提供了支持。

**研究背景与问题提出**

装饰性喷泉构成了水体、石材与生物群落相互作用于历史塑造的开放景观中的复杂界面。其价值不仅在于建筑元素本身，更在于作为嵌入花园与半自然环境中的社会-生态系统的整体功能，材料保护的实现依赖于周围生物与环境动态的稳定。在阿尔罕布拉宫与赫内拉利费这类开放纪念性空间中，装饰性喷泉与水生无脊椎动物、两栖动物、鸟类及多样植物群落共存，这些生物依赖于稳定的水质条件。因此，控制光合生物定殖的策略不仅要保护石材基质，还需与周围生物多样性兼容。

光合微生物（包括蓝藻、绿藻和硅藻）的定殖是装饰性喷泉面临的最持续性威胁之一。这些生物定殖多孔石材表面并形成生物膜，导致变色、表面粗糙化、光泽丧失及材料渐进性弱化。传统控制策略依赖苯扎氯铵、次氯酸钠及含氯制剂等化学杀菌剂，虽短期有效，但存在严重生态与材料缺陷：非选择性毒性破坏本地微生物群落，可能影响非目标动植物，改变喷泉水体的物理化学性质；重复应用可氧化金属构件、降解保护性风化层、与碳酸盐基质反应以增加孔隙度和表面脆性；此外，多种光合类群已对常规杀菌剂产生适应性抗性。在蓝藻系统中，化学胁迫甚至可能刺激微囊藻毒素等细胞内毒素的释放，进一步恶化水质并增加生态风险。

有害藻华（Harmful Algal Blooms, HABs）研究为应对这一挑战提供了可迁移的生态框架。在HAB管理中，杀藻细菌作为生物调控因子崭露头角，能够通过直接细胞相互作用或分泌胞外生物活性代谢物（如脂肽、吲哚、酚类和环二肽）抑制或裂解微藻和蓝藻。尽管基于芽孢杆菌（Bacillus）复合体的商业制剂已在养殖系统中展现出降低藻类生物量和稳定物理化学参数的能力，但将其转化为历史装饰性喷泉等文化遗产场景的应用仍处于 largely unexplored 的状态。研究假设，这些本地微生物群落中 harboring 具有功能杀藻潜力的细菌分类群，能够在调节光合生物生长的同时保持生态系统稳定性，降低与外源微生物引入相关的生物安全和生态风险。

**研究目标与技术路线**

为验证该假设，研究人员开展了以下研究：（i）通过16S rRNA基因测序表征阿尔罕布拉宫与赫内拉利费多处喷泉的细菌群落；（ii）进行统计学分析以探索细菌群落结构与光合生物膜发育的关系；（iii）筛选喷泉水样对生物风化性光合生物的抑制活性；（iv）鉴定与抑制性样本相关的细菌分类群，以表征本地微生物组中具有推定杀藻能力的成员；（v）利用PAM荧光测定法和Neubauer计数室评估选定细菌培养物对代表性微藻的抑制效应。

**关键技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：基于16S rRNA基因（采用27F/1492R引物或16S Barcoding Kit SQK-16S024）的纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies MinION平台）进行微生物组表征；基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）、置换多变量方差分析（PERMANOVA）等多元统计方法分析群落结构；以Chlorella vulgaris为模型生物，通过24孔板培养体系进行喷泉水样功能筛选，以Neubauer计数室定量并计算生长曲线下面积（area under the curve, AUC）和生长抑制率；对活性最强样本采用涂布平板法在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上进行细菌分离，经16S rRNA基因Sanger测序（引物16SF1/1492R）及NCBI BLASTn比对鉴定；通过共培养实验（1:1体积比，OD₆₀₀=1.5对应2.20×10⁸ CFU·mL^-1）结合PAM荧光测定法（FP 110 FluorPen及PAM-2000）和显微观察（Nikon ECLIPSE TS100倒置显微镜）验证杀藻活性。样本队列来源于西班牙格拉纳达阿尔罕布拉宫与赫内拉利费纪念性建筑群内的八处装饰性喷泉系统。

**研究结果**

**3.1 装饰性喷泉的微生物组表征**

细菌微生物组包含分布于八个样本的41个属。分类组成显示采样点间存在显著异质性。Rheinheimera为数据集中最丰富的属（平均相对丰度31.13%），其次为Acidovorax（13.68%）、Pseudomonas（9.70%）和Aeromonas（7.45%）。层级聚类热图显示S5与其余样本明显分离，其余样本分为两个更广泛的组成群。核心微生物组定义为在至少75%样本中检测到的细菌属。

**3.2 细菌多样性模式与群落结构**

Alpha多样性分析显示，高生物膜样本的观测丰富度（15.67 vs. 8.40属；χ²=4.408, p=0.036, q=0.048）、Shannon指数（2.257 vs. 1.576；χ²=5.000, p=0.025, q=0.048）和Simpson指数（0.846 vs. 0.729；χ²=5.000, p=0.025, q=0.048）均显著高于低生物膜样本，但Pielou均匀度无显著差异。Beta多样性方面，基于Bray-Curtis相异性的PCoA显示前两轴解释56.9%的总组成方差，样本按生物膜类别未形成明确聚类。PERMANOVA表明生物膜类别仅解释13.2%的组成方差且不显著（R²=0.132, pseudo-F=0.915, p=0.579）；PERMDISP和ANOSIM同样未显示类别间差异。

**3.3 已报道杀藻活性属的出现**

18个已报道具有杀藻活性的属在微生物组中被检出，占各样本总相对丰度的61%至100%（均值81.85%±15.10%）。Flavobacterium和Rheinheimera存在于100%的样本中，Acidovorax存在于88%，Pseudomonas存在于75%。然而，生物膜类别间在杀藻属总相对丰度（Kruskal-Wallis, p=0.10, q=0.17）和丰富度（p=0.17, q=0.17）的差异均未达统计学显著性。

**3.4 喷泉水样对Chlorella vulgaris的抑制效应**

生长曲线显示处理间存在显著差异。对照组C. vulgaris呈渐进生长，而S1显示促进效应（约-30%抑制率，即刺激生长）。S3表现出最强的藻类生长抑制作用：细胞密度在整个实验中保持极低水平，第14天仅达约10⁴ cells·mL^-1，抑制率约90%。S8亦显示强抑制效应（84-85%）。统计学比较确认仅S3和S8与未处理对照存在显著差异（Dunnett检验，p=0.001和p=0.002）。S5和S7显示中等抑制（约44%和41%），S2、S4和S6效果较弱。

**3.5 优势抑制细菌的分离与鉴定**

从筛选实验中杀藻活性最强的样本中分离得到的优势菌株被鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）LIG25菌株（GenBank登录号PX631962.1）。同一样本中分离的Microbacterium oxydans LIG25和Microbacterium foliorum LIG25在筛选实验中未显示杀藻活性。

**3.6 分离菌株S. maltophilia LIG25在共培养中的杀藻活性**

PAM荧光测定结果显示光合效率（Fv/Fm）在实验初期即迅速下降：72小时实验中，Fv/Fm从约0.700降至24小时内的0.020；24小时高时间分辨率实验中，初始Fv/Fm（0.695）在首小时内降至约一半（0.350），随后持续下降，9小时达最低值0.016后维持低位波动。各对照组（BG-11培养基、C. vulgaris+LB、C. vulgaris+pH 8.4调整LB）Fv/Fm稳定于0.690-0.650。细胞计数证实对照组72小时内呈指数增长至(2.27±0.08)×10⁵ cells·mL^-1，而细菌共培养仅在前48小时略有增长，72小时降至(3.80±1.46)×10³ cells·mL^-1，抑制率约98.3%。显微观察 thumbnail: 对照细胞保持正常球形形态和完整色素，经S. maltophilia LIG25处理5天的细胞出现形态变形、细胞完整性丧失、胞内内容物解离、光合色素脱落、淀粉核消失或模糊，以及细胞崩溃和裂解现象。

**讨论**

**群落异质性与生物膜-多样性关系**

研究结果表明，阿尔罕布拉宫与赫内拉利费的装饰性喷泉 harboring 空间异质性的细菌群落，其分类组成、多样性和对C. vulgaris的功能响应均存在差异。高生物膜样本具有显著更高的alpha多样性，暗示光合生物膜可能通过提供定殖空间、有机底物和微尺度保护来增加局部生境复杂性，从而促进额外细菌分类群的纳入。然而，这种多样性差异未转化为整体群落组成在类别间的清晰分离，PERMANOVA、PERMDISP和ANOSIM均未支持生物膜类别作为群落结构的主要驱动因素。

**分类学-功能解耦的核心发现**

18个已报道杀藻属的广泛存在（占群落61-100%）表明细菌-微藻相互作用可能是这些喷泉正常生态动态的组成部分，但 genus-level 分类学鉴定不能假定所有检出菌株均保留该活性或在该系统特定条件下表达该活性。S6样本清晰阐释了这一解耦：尽管Trade 100%的细菌群落由已报道杀藻属组成，却属于低生物膜类别且未在功能筛选中显示最强抑制响应。这说明潜在拮抗细菌的存在不足以解释生物膜状态或预测实际生物防治能力，有效丰度、种株水平变异、环境对生物活性代谢物产生的调控、细菌间相互作用以及生物膜基质的物理结构等因素均可能参与其中。

**功能筛选与候选菌株验证**

功能筛选证实并非所有水生微生物组具有相同生物防治潜力：S3和S8显示强内源抑制活性，S1甚至产生促进效应，其余样本效应中等或有限。这种功能异质性强化了基于实验证据而非仅凭分类学选择候选菌株的必要性。从S3中分离的S. maltophilia LIG25经实验验证为强效杀藻菌，而同样本分离的M. oxydans和M. foliorum未显示活性，进一步证明"抑制性微生物组中的细菌存在并不意味着其负责观察到的效应"。

**S. maltophilia LIG25的杀藻机制与特性**

S. maltophilia LIG25对C. vulgaris施加了快速、强烈且多维的抑制效应：Fv/Fm在24小时内急剧下降至接近零值，表明光系统II（PSII）的光损伤和电子传递受损构成早期事件；细胞计数显示该生理破坏伴随增殖的极端抑制和细胞密度的进行性丧失；显微观察揭示球形形态变形、胞内结构解离、光合色素丧失、淀粉核消失及细胞裂解。LB培养基和pH调整对照未再现Fv/Fm下降，排除了细菌培养基或pH变化的简单后果，强化了效应归因于细菌相关生物活性或其胞外产物的观点。

**应用前景与生物安全考量**

S. maltophilia作为环境多能菌，已在文化遗产保护中有成功应用先例（如罗马Casina Farnese壁画清洁）。然而，其作为机会性病原菌的身份提示，在开放遗产环境或公共空间直接应用活体可能面临监管、生态和生物安全约束。未来研究的关键方向包括：（i）鉴定负责杀藻活性的代谢物、酶或胞外组分，转向无细胞滤液或胞外产物制剂的开发；（ii）评估对蓝藻、硅藻和石生绿藻等其他光合作用生物及混合群组的活性谱；（iii）探索基于细菌组合或复合体的完整生物防治策略，通过互补机制拓宽控制谱。

**研究结论**

阿尔罕布拉宫和赫内拉利费的装饰性喷泉 harboring 对参与生物风化的光合微生物具有潜在抑制活性的细菌微生物组。微生物组分析与功能筛选的结合表明，这些遗产水生系统可能是本地细菌候选资源的宝贵来源，因而成为开发更可持续管理策略的相关基础。多个样本中抑制活性的检出，以及嗜麦芽窄食单胞菌LIG25作为杀藻细菌的分离和实验验证，为这些系统中本地细菌可能参与光合生长调控的微生物相互作用提供了初步证据。尽管这尚未构成经证实的管理工具，但为装饰性喷泉微生物组启发型生物防治策略的未来研究奠定了坚实的实验基础。总体而言，本研究为开发更具选择性、更可持续且与遗产兼容的方法提供了起点，以限制有害光合微生物的过度生长，同时保护历史材料及其周边环境的生态平衡。