新生少突胶质细胞中TFEB信号传导与自噬受扰导致中枢神经系统髓鞘异常生成

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Disruption to TFEB signaling and autophagy in newly formed oligodendrocytes leads to aberrant generation of CNS myelin

　　

髓鞘是脊椎动物神经系统的标志性结构，但维持其完整性的细胞与分子机制仍知之甚少。研究人员在本研究中利用体积电子显微镜（volume electron microscopy）和针对新生少突胶质细胞的敲入小鼠系，重建了视神经早期髓鞘形成过程，并考察了视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）轴突的包裹（ensheathment）情况。研究发现，新近形成的髓鞘表现出膜性突起以及偶发的退行性髓鞘“旋涡”（whorls）。在新生少突胶质细胞中条件性破坏转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）-自噬（autophagy）通路后，这些异常髓鞘结构的丰度显著增加，提示该通路是正常髓鞘形成及其完整性所必需的。重要的是，该通路的作用独立于TFEB已被充分证实的另一功能，即抑制髓鞘生长。综上，研究结果鉴定出TFEB依赖性自噬在发育过程中建立正常髓鞘结构中的作用，并为调控髓鞘完整性的少突胶质细胞内在机制提供了见解。

该论文发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》，聚焦中枢神经系统（central nervous system，CNS）发育性髓鞘形成过程中一个长期未被充分阐明的问题：在轴突包裹启动及快速推进阶段，少突胶质细胞如何在大规模扩展膜结构的同时维持髓鞘结构完整性。既往研究已表明，发育过程中可出现髓鞘外褶、髓鞘-髓鞘样结构及髓鞘旋涡等异常，并且类似异常也可见于脱髓鞘疾病模型及多发性硬化早期病变。然而，这类异常究竟如何在正常发育中被限制，尤其哪些少突胶质细胞内在机制负责抑制异常髓鞘结构的产生，仍不清楚。TFEB此前已被证明可作为CNS髓鞘形成的分子“制动器”，通过促进髓鞘前少突胶质细胞凋亡以及抑制胆固醇生物合成来限制髓鞘生长，但其是否还参与髓鞘结构质量控制尚未明确。因此，开展本研究的必要性在于揭示发育期髓鞘完整性建立的细胞内在调控轴，并阐明TFEB在经典“抑制髓鞘生长”功能之外是否还承担独立作用。

研究人员围绕新生少突胶质细胞中的TFEB-自噬轴开展系统研究，得出核心结论：TFEB在视神经发育早期高表达于新生少突胶质细胞，并通过促进自噬通量（autophagic flux）来限制髓鞘膜突起及髓鞘旋涡的产生，从而保障发育期髓鞘结构的正常建立；当TFEB信号或自噬过程受损时，异常髓鞘结构显著积累，并伴随视觉传导延迟。该研究的重要意义在于，提出了一个少突胶质细胞内在的髓鞘质量控制机制，将TFEB依赖性自噬与发育期髓鞘完整性直接联系起来，为理解脱髓鞘疾病中早期髓鞘异常的发生机制提供了新的理论线索。

在技术方法上，研究主要结合了多层次结构学、遗传学与功能学手段。首先，采用连续块面扫描电子显微镜（serial block-face scanning electron microscopy，SBEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）对小鼠早期出生后视神经进行三维重建和超微结构分析。其次，利用多种条件性基因工程小鼠，包括Olig2-Cre、Enpp6-IRES-CreERT2、Cnp-Cre驱动的Tfeb或Atg5条件敲除模型，以及mT/mG谱系示踪系统，对新生少突胶质细胞及其髓鞘进行特异性标记和功能删除。再次，通过免疫荧光、原位杂交、CUT&RUN数据挖掘、免疫电镜和视觉诱发电位（visual evoked potential，VEP）评估分子表达、自噬状态、髓鞘形态与视觉传导功能。样本主要来源于小鼠出生后P5、P7和P14阶段的视神经组织。

在结果部分，研究首先在“TFEB Is Expressed by Newly Formed Oligodendrocytes and Limits Myelin Whorl Number During Optic Nerve Development”中表明，TFEB在出生后早期视神经中广泛表达，并且几乎存在于全部Enpp6阳性新生少突胶质细胞中。通过Olig2-Cre介导的Tfeb条件敲除及TEM分析，研究人员发现P14时视神经中的髓鞘旋涡密度显著升高，达到对照组的3至4倍，而髓鞘外褶密度和正常髓鞘化轴突比例并未改变。这说明TFEB缺失并非普遍破坏髓鞘形成，而是特异性增加了髓鞘旋涡这一类异常结构。此外，Tfeb缺失同时伴随髓鞘厚度增加，提示其在髓鞘发育中的作用具有多面性。

在“The Majority of Myelin Whorls Are Located Within the Cytoplasm of Oligodendrocytes and Are Associated with Myelinated Axons”部分，研究利用超高分辨率TEM与SBEM三维重建，解析了髓鞘旋涡的空间构型和亚细胞定位。结果显示，绝大多数髓鞘旋涡被完整髓鞘包绕，并与已髓鞘化轴突相连；在对照和Tfeb条件敲除中，分别有86.32%和77.08%的旋涡属于与髓鞘化轴突相连的“attached”类型。进一步分析表明，这些结构位于少突胶质细胞质内，处于少突胶质细胞质膜与致密髓鞘之间，而非位于轴突膜内或轴周细胞外空间。Tfeb条件敲除视神经中旋涡总体积占比升高，旋涡总数增多，但单个旋涡体积更小，且常呈簇状分布。这一结果说明，TFEB缺失主要导致大量较小的异常髓鞘结构在少突胶质细胞内积聚。

在“TFEB Functions Cell-Autonomously in Newly Formed Oligodendrocytes to Remodel Myelin Membrane and Limit Whorl Number During the Initiation of Axon Ensheathment”部分，研究进一步界定了TFEB的细胞自主性作用及其发生时相。首先，CC1、Olig2和PDGFRα染色显示，Tfeb条件敲除并未改变视神经中少突胶质细胞谱系细胞数量，这与脑内既往发现不同，排除了“少突胶质细胞数量异常增多导致旋涡增多”的解释。随后，研究通过阻断BAX/BAK依赖性凋亡增加少突胶质细胞数目，但并未引起髓鞘旋涡增加，进一步支持旋涡表型并非继发于细胞数变化。时间上，研究利用髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）免疫标记发现，在P5至P7这一轴突包裹起始阶段，对照组视神经中已可见大量沿纵向髓鞘突起形成的MBP阳性膜突起，而Tfeb条件敲除组该类突起密度增加2至4倍。P7时TEM进一步证实，Tfeb条件敲除已出现明显增多的髓鞘旋涡，但髓鞘化轴突密度未变。免疫电镜显示，这些旋涡被MBP阳性髓鞘包裹，其中大多数内部也可检测到MBP相关沉积，支持膜突起与旋涡在来源上的相关性。最后，借助Enpp6-IRES-CreERT2; mT/mG系统对新生少突胶质细胞进行稀疏标记，研究显示正常情况下P7到P14期间膜突起数目下降而单个突起面积增大，提示轴突包裹过程中存在髓鞘膜重塑；而在新生少突胶质细胞中特异性删除Tfeb后，单细胞层面的GFP阳性膜突起数显著增多而面积变小，证明TFEB在新生少突胶质细胞内以细胞自主方式限制异常髓鞘膜突起。

在“TFEB Enhances Autophagic Flux to Reduce Myelin Membrane Protrusions and Myelin Whorls”部分，研究转向机制层面的解析。基于既往TFEB CUT&RUN数据，研究发现TFEB可直接结合一组覆盖自噬全过程的基因，包括Atg101、Atg14、Uvrag、Atg16l1、Atg12、Atg10、Atg3及Gabarap，提示TFEB可能直接促进少突胶质细胞自噬程序。功能上，Tfeb条件敲除视神经中CC1阳性少突胶质细胞的SQSTM1/p62信号增强，表明自噬通量受损。为验证自噬是否确为限制异常髓鞘结构所必需，研究构建了Cnp-Cre; Atg5^F/F条件敲除小鼠。结果显示，Atg5缺失同样导致p62积聚、P7期MBP阳性膜突起密度增加，并在P7和P14两个时间点均引起髓鞘旋涡密度显著升高，而少突胶质细胞数量和髓鞘化轴突密度均无改变。尤其关键的是，Atg5条件敲除与Tfeb条件敲除在P7期MBP阳性突起密度和髓鞘旋涡密度上表现不可区分，强烈支持TFEB与自噬位于同一功能通路中，共同抑制异常髓鞘结构形成。

随后，在“Genetic blockade of autophagy in oligodendrocytes increases myelin whorl density but does not affect myelin sheath thickness during optic nerve development”中，研究明确区分了TFEB的两种功能。既往研究已知TFEB能抑制髓鞘生长，而本研究发现Atg5条件敲除虽然复制了髓鞘旋涡增多的表型，却并未改变P14视神经的g-ratio，也即不影响髓鞘厚度。尽管Atg5缺失组中大直径轴突的髓鞘化比例有所上升，但不同轴径范围内的g-ratio均未发生变化。这表明，TFEB介导的自噬依赖性膜重塑与旋涡抑制功能，独立于其既往已知的“抑制髓鞘增厚”作用。换言之，TFEB不仅调控髓鞘数量或厚度，还负责髓鞘结构质量控制。

在“Tfeb and Atg5 cKO Mice Exhibit Impaired Visual Function”部分，研究评估了结构异常的功能后果。视觉诱发电位检测显示，P14时Tfeb条件敲除小鼠在0.1和0.5 cd s/m²光刺激强度下出现显著N1潜伏期延长，其中0.5 cd s/m²时平均延迟约10 ms，提示视网膜至视觉皮层的信号传导减慢，而N1振幅未见显著差异。Atg5条件敲除小鼠也出现类似VEP表型。研究同时排除了郎飞结（node of Ranvier，NoR）密度异常及旁结超微结构缺陷所致的解释，因为Tfeb条件敲除视神经中的Caspr与AnkG双阳性NoR密度和旁结结构均保持正常。因此，研究结果支持：新生少突胶质细胞中TFEB-自噬轴受损，可在髓鞘快速形成阶段引发异常髓鞘生成，并伴随可检测的视觉传导功能缺陷。

讨论部分进一步整合了上述发现。研究指出，在髓鞘建立、维持及损伤修复过程中，髓鞘都经历显著重塑；借助Enpp6-IRES-CreERT2这一特异标记髓鞘前少突胶质细胞的工具，小鼠体内早期轴突包裹阶段得以被精细解析。研究强调，Tfeb与Atg5条件敲除共同导致MBP阳性膜突起和髓鞘旋涡增多，且这些结构多与髓鞘化轴突紧密相关、被MBP阳性髓鞘包裹，说明它们是发育期髓鞘异常的重要形态学表现。作者同时谨慎指出，尽管膜突起与旋涡高度相关，但现有证据尚不足以直接证明前者必然演变为后者；同样，目前也未直接观察到自噬结构吞噬髓鞘旋涡，因此不能排除自噬通过膜稳态广泛调控而间接影响旋涡丰度。关于细胞间协同，研究结合既往文献指出，小胶质细胞可吞噬MBP阳性碎片甚至整段髓鞘，而本研究识别出一部分脱离轴突的旋涡，提示少突胶质细胞内在的TFEB指导自噬与小胶质细胞介导的胞外清除可能共同维持髓鞘完整性。研究还指出，视神经中TFEB缺失并不影响少突胶质细胞数量，说明其在该区域未必参与或并非唯一参与少突胶质细胞凋亡调控，但其促进自噬、推动髓鞘膜重塑和减少旋涡的作用十分明确。最后，作者强调，尽管Tfeb与Atg5条件敲除均表现出VEP潜伏期延长，但过量髓鞘旋涡与传导延迟之间的直接因果关系仍有待未来借助更特异工具深入检验。

研究结论可概括为：TFEB依赖性自噬在发育过程中建立正常髓鞘结构方面发挥关键作用，并为理解调控髓鞘完整性的少突胶质细胞内在机制提供了重要见解。