利用基因聚合技术培育兼具优质纤维、高产及盐胁迫耐受性的棉花初始基因型

《Journal of Plant Interactions》：Development of high fiber quality, high-yielding, and salt stress-tolerant initial cotton genotypes using gene pyramiding technology

　　

标记辅助选择（MAS）可加速传统育种进程并实现目标性状的精确评价。基因聚合（gene pyramiding）是将多个有利基因组合以改良植株性能的有效策略。本研究采用基因聚合方法，将与高纤维强度、盐胁迫耐受性及增产相关的基因整合至单一基因型中。研究人员利用7份陆地棉（Gossypium hirsutum）栽培种/品系构建复合F2群体，并通过表型与分子方法进行评估。盐耐受性在150和200 mM NaCl处理下的萌发期及早期幼苗阶段进行评价。纤维品质性状采用HVI（High Volume Instrument）系统测定，产量潜力通过皮棉百分率估算。分子分析使用160个SSR（Simple Sequence Repeat）标记，其中55个表现多态性，共检测到152个等位基因，揭示出丰富的遗传多样性（每个位点2.76个等位基因；PIC = 0.37–0.66；He = 0.41–0.66）。研究鉴定出聚合有利性状的优良F2个体，其纤维强度达34.4–37.4 g/tex，皮棉百分率高达39.05%，且在盐胁迫下表现稳定。这些结果表明，MAS与基因聚合相结合可有效将三个亲本基因型的纤维品质、产量及盐耐受性有利等位基因整合至单一遗传背景中，为棉花改良提供了有前景的策略。

棉花（Gossypium spp.）是世界上最重要的天然纤维作物，其栽培历史可追溯至公元前五千世纪的印度河流域。尽管陆地棉（Gossypium hirsutum）占全球棉花种植面积的95%以上，但该物种存在纤维品质相对较低、对非生物和生物胁迫耐受性与抗性有限等问题。传统育种方法在改良这些复杂性状时面临周期长、效率低等局限，而分子标记辅助选择（MAS）技术为突破这一瓶颈提供了新途径。基因聚合策略能够将多个有利基因整合至单一基因型，但目前在棉花中同时整合纤维品质、产量和盐胁迫耐受性的研究仍显不足，尤其是在盐碱地分布广泛的干旱半干旱地区，培育兼具高产优质和耐盐性的棉花品种对于保障农业可持续生产具有重要战略意义。

研究人员选取来自乌兹别克斯坦棉花种质库的7份陆地棉种质材料开展研究，包括半野生类型subsp. purpurascens（耐盐供体）、subsp. gambia（高强纤维供体）和高产品种Namangan 77（高产供体）。研究目标是通过基因聚合策略将盐胁迫耐受性、优质纤维和高产性状整合至单一遗传背景，具体包括评价目标性状的表型变异、筛选与这些性状高度多态的SSR标记以辅助MAS，以及分析亲本系间的遗传关系。研究在150 mM和200 mM NaCl控制条件下重点量化萌发期和早期幼苗阶段的耐盐性，以确保聚合基因型的稳定性。

本研究采用的关键技术方法主要包括：（1）基于CTAB法的基因组DNA提取与NanoDrop定量，建立25 ng/μL工作浓度的DNA模板库；（2）SSR分子标记筛选与PCR分析：从160个SSR标记中筛选出55个多态性标记进行背景选择，并确定JESPR152（耐盐性）、NAU1042（产量）和BNL3594（纤维强度）三个前景选择标记；（3）盐胁迫耐受性表型鉴定：设置150 mM和200 mM NaCl两个盐浓度梯度，在恒温生长箱（32/25 °C，16/8 h光周期）中进行标准发芽试验，测定发芽率、相对生长率（RGR）、盐耐受指数（STI）和发芽速度指数（GSI）等指标；（4）温室幼苗期胁迫试验：在35/20 °C温控条件下，对真叶期幼苗进行15天盐胁迫处理，系统测定根长、茎长、鲜重、干重等形态参数；（5）纤维品质HVI检测与产量指标测定：按UzDSt 604:2016国家标准，在20–22 °C、相对湿度65%±2%条件下测定14项纤维品质参数，并计算皮棉百分率（LP）；（6）遗传多样性分析：计算多态信息含量（PIC）、杂合度（He）等参数，并采用 membership function value（MFV）综合评定耐盐性。

**亲本材料的形态学特征与选择依据**

subsp. purpurascens作为耐盐供体被选用，其基因组分析和前期筛选证实该类型对盐碱胁迫具有高度耐受性，能在高盐环境中良好生长。subsp. gambia作为受体亲本，其核心育种价值在于纤维强度超过33 g·tex^-1，显著优于其他野生类型，株高140–150 cm，茎密被绒毛。Namangan 77品种则提供了高产遗传背景，具有合轴生长习性，铃重5.0–5.5 g，纤维产量达38%–39%。通过聚合这三种遗传背景差异显著的材料，研究旨在将subsp. purpurascens的非生物胁迫抗性与subsp. gambia的纤维优异性状以及Namangan 77的生产力相结合。

**杂交组合的成铃与种子结实性状**

在F₁、复合F₁和F₂杂交组合中，成铃率分别为35.33%、74.48%和91.88%，完全发育种子百分率分别为71.61%、67.83%和90.28%，差异均达到统计学显著水平。在subsp. punctatum var. gambia × subsp. purpurascens的F₁组合中，成铃率35.33%，完全发育种子率71.61%±4.33%，变异系数13.52%，遗传力估计值hp = 0.69，呈正向不完全显性趋势。在复合F₁组合（subsp. punctatum var. gambia × subsp. purpurascens）× Namangan 77中，成铃率74.48%，平均完全发育种子67.83%±1.43%，变异系数4.73%，遗传力hp = -1.42，表现为负向超显性遗传。在复合F₂组合中，成铃率达91.88%，平均完全发育种子90.28%±3.89%，变异范围79.48%–100%，遗传力h² = 0.51，呈正向不完全显性。方差分析（ANOVA）显示基因型对成铃率具有极显著效应（F = 17.66, p < 0.001），支持了所选F₂杂交组合生殖性能改善的遗传基础。

**纤维皮棉百分率**

亲本纤维产量（皮棉百分率）变异范围为30.55%至38.29%。栽培品种Namangan 77皮棉百分率最高，达38.29%±0.29%；半野生类型subsp. punctatum var. gambia最低，为30.55%±1.00%；subsp. purpurascens居中，为31.28%±0.67%。在杂交组合中，F₂复合杂交后代平均皮棉百分率最高，达39.05%±0.91%，变异系数11.92%，性状遗传呈正向显性（hp = 0.91）。F₁代皮棉百分率为33.23%±0.80%，呈正向超显性遗传（hp = 6.34）。复合F₁组合（(subsp. punctatum var. gambia × subsp. purpurascens) × Namangan 77）皮棉百分率36.02%±0.73%，表现为中间型显性（hp = 0.1）。尽管Namangan 77作为高产标准对照，但其在复合F₁中未显示明显优势，复合杂交导致基因间上位性互作、等位基因兼容性降低及显性基因不完全表达，限制了表型优势的发挥，产生负向杂种优势。单因素ANOVA证实各基因型间差异极显著（F = 7.11, P < 0.001）。

**纤维品质性状**

马克隆值（micronaire）方面，subsp. punctatum var. gambia为4.2±0.13，subsp. purpurascens为5.3±0.14，Namangan 77为4.7±0.09。断裂强度比较显示，subsp. punctatum var. gambia最高（33.9±0.24 g/tex），Namangan 77次之（29.1±0.37 g/tex），subsp. purpurascens最低（24.9±0.05 g/tex）。在基于MAS筛选的两个优选F₂复合杂交组合中，纤维长度1.22±1.48至1.24±0.91英寸，伸长率7.5%±0.23%至7.6%±0.18%，强度34.4±0.31至37.4±0.25 g/tex，马克隆值3.81±0.22至3.82±0.27。复合F₁组合马克隆值4.1±0.11，纤维强度33.7±0.32 g/tex，伸长率6.8%±0.11%，平均纤维长度1.26±0.79英寸。单因素ANOVA揭示亲本系和杂交群体间纤维强度存在极显著基因型差异（F = 87.31, P < 0.001），马克隆值（P < 0.001）、纤维长度（P < 0.01）和伸长率（P < 0.05）亦达显著水平。这些结果表明，通过基因聚合方法，所选F₂复合杂交组合中观察到的增强纤维强度（达37.4 g/tex）与供体subsp. punctatum var. gambia的目标等位基因成功累积密切相关。

**种子发芽试验**

双因素ANOVA显示基因型、盐水平及其交互作用对种子发芽均有极显著影响（F = 17.66, P < 0.001）。对照条件下，subsp. purpurascens和Namangan 77发芽率最高（9.67±0.33粒），subsp. punctatum var. gambia和Ravnak 1较低。增加盐浓度导致大多数基因型发芽率显著下降，但降幅因基因型而异。150 mM NaCl下，subsp. purpurascens保持较高发芽率（8.67±0.67粒），显示对中等盐胁迫的强耐受性；而Namangan 77和Marie-galante急剧下降，证实其发芽阶段盐敏感。200 mM NaCl严重胁迫下，敏感基因型发芽大幅降低，但subsp. purpurascens和Bukhara 8仍保持相对较高发芽能力。复合F₂杂交组合在所有盐水平下表现稳定且发芽率较高，反映出增强的遗传适应性和盐耐受性状的有效的有效遗传。

**根长和茎长的形态参数**

双因素ANOVA表明茎长受基因型（F = 10.10, P < 0.001）、盐处理（F = 18.85, P < 0.001）及其交互作用（F = 4.52, P < 0.001）的显著影响。对照条件下各亲本和杂交组合茎生长较为一致。150 mM NaCl下，基因型特异性响应显现：subsp. punctatum var. gambia和简单F₁杂交组合茎伸长明显受抑。200 mM NaCl下，茎生长抑制普遍发生，但程度显著不同：敏感基因型Marie-galante抑制最甚，而Bukhara 8和subsp. purpurascens保持较优茎长。值得注意的是，F₂杂交群体在高盐下较简单F₁和复合F₁代增强活力，茎长与最耐盐亲本相当，表明选择过程有效富集了早期胁迫下有利的茎生长等位基因。

根长同样受基因型（F = 10.42）和盐处理（F = 19.96）显著影响，随NaCl浓度增加呈一致抑制趋势。整个试验过程中，subsp. purpurascens、Bukhara 8和F₂群体在所有盐胁迫水平下根长始终居于最高统计分组，而敏感基因型如Marie-galante随胁迫加剧跌入最低Tukey分组。F₂群体强健的根生长进一步证实了基因聚合方法改善早期耐盐性的生物学意义。

**植株鲜重和干重**

植株干重分析显示基因型（F = 9.80, P < 0.001）和环境（F = 15.78, P < 0.001）效应显著，但基因型与盐水平交互作用不显著（F = 0.55, P = 0.92），表明增加NaCl浓度对大多数材料遵循相似抑制趋势。基于生物量保持而非绝对值评价耐受性时，subsp. purpurascens和Ravnak 1仅随NaCl浓度增加表现轻微干重降低，显示优越耐盐性。F₂群体在各胁迫处理下表现中等但稳定的生物量，表明从亲本系部分转移了胁迫适应性状。Khorezm 128尽管对照条件下干重较高，但盐胁迫下下降更明显，表明相对耐受性较低。

双因素ANOVA显示鲜重受基因型（F = 23.91, P < 0.001）、环境（F = 48.02, P < 0.001）及其交互作用（F = 3.68, P < 0.001）的极显著影响。Tukey比较显示，亲本栽培种和F₁杂交组合随NaCl浓度增加鲜重显著降低，多种基因型在200 mM时跌入较低统计分组。相反，F₂群体在对照、150 mM和200 mM NaCl下始终保持高值，常居于最高Tukey分组，甚至在150 mM中度胁迫下略有增加，暗示增强的适应能力。敏感基因型如Marie-galante和Khorezm 128在严重盐胁迫下急剧下降。这些观察突出F₂群体在盐胁迫下兼具稳定性和优越性能，支持基因聚合改善棉花耐盐性的有效性。

**基于MFV的耐盐性综合评价**

通过计算四种性状平均MFV值评价耐盐性：subsp. purpurascens为0.93，Bukhara 8为0.74，Ravnak 1为0.64，Namangan 77为0.48，subsp. marie galante为0.34，subsp. gambia为0.22，Khorezm 128为0.16。比较杂交组合与亲本MFV值，subsp. purpurascens为0.87，复合F₂杂交型为0.83，复合F₁（subsp. gambia × subsp. purpurascens）× Namangan 77为0.56，F₁（subsp. gambia × subsp. purpurascens）为0.54，Namangan 77为0.41，subsp. gambia为0.07。

**分子分析**

在160余个与盐胁迫耐受性、产量和纤维品质相关的SSR标记中，55个表现多态性，102个为单态性，3个未产生PCR产物。通过比较亲本多态性水平，筛选出三个目标标记：JESPR_152用于盐胁迫耐受性选择，NAU_1042用于产量指标（皮棉百分率）选择，BNL_3594用于纤维强度选择。对186个样本进行PCR分析，从中选取35个耐盐性最高且目标纤维品质和产量指标最优的基因型，其中2个基因型（26号和122号）对三个DNA标记均为纯合。在复合F₂（subsp. punctatum var. gambia × subsp. purpurascens）× Namangan 77的BNL 3594标记分析中，35个样本中10个表现受体基因型（subsp. punctatum var. gambia）类似QTL区域且为纯合，25个为杂合。JESPR_152等位分析中，17个杂种为纯合，13个杂合，5个完全缺失该等位基因。NAU_1042 SSR标记分析显示，2个样本具有显性（Namangan 77）基因型且对QTL区域纯合，24个杂合，9个无扩增产物。

**讨论与结论**

研究通过基因聚合方法初步整合了不同野生和栽培棉花种质的重要有利性状。150和200 mM NaCl控制条件下，subsp. purpurascens在早期生长阶段表现出优异耐盐性。双因素ANOVA结果揭示了盐响应中显著的基因型差异，尤其在生物量（鲜重和干重）和早期幼苗生长参数方面。萌发试验中，subsp. purpurascens、Bukhara 8和复合F₂杂交组合在胁迫下保持相对较高性能（F = 17.66, P < 0.001）。鲜重分析显示subsp. marie-galante和Khorezm 128显著下降（F = 48.02, P < 0.001），而subsp. purpurascens、Bukhara 8和Ravnak 1降幅最小。茎长的显著基因型×盐度交互作用（F = 4.52, P < 0.001）证实生长响应高度依赖遗传背景。STI分析表明Namangan 77、subsp. purpurascens和复合F₂杂交组合在根长和茎长方面表现有前景的抗性水平。F₂群体在严重胁迫下的相对稳定性指向有利等位基因的成功组合，但稳定遗传和基因固定需在后续世代中确认。

纤维产量和品质指数通过表型数据和SSR标记评价。NAU1042等标记鉴定了不同表型类群，皮棉百分率范围30.55%–39.05%。BNL 3594 SSR标记用于评估纤维强度，subsp. punctatum var. gambia为33.9 g/tex，复合杂交组合达37.4 g/tex（F = 87.31）。然而这些F₂基因型仍处于遗传分离早期阶段，聚合性状——盐耐受性、纤维品质和产量——的稳定性和固定必须在高级世代（如F₆–F₇）中验证。此外，温室评价未能完全复制田间盐胁迫的复杂动态，大规模田间验证是确认这些有前景初始基因型实用育种价值的必要步骤。

**研究结论翻译**

本研究采用分子和表型方法评价了乌兹别克斯坦本地陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培种和半野生种质的纤维品质、盐胁迫耐受性和产量性状。subsp. gambia种质表现出优越的纤维强度（33.9 g/tex），而subsp. purpurascens和Bukhara-8品种在早期生长阶段表现出增强的盐胁迫耐受性。统计关联分析确定JESPR152₂₁₀、NAU1042₂₅₀和BNL3594₂₂₅等位基因为耐盐性、皮棉百分率和纤维强度的可靠标记位点。此外，复合F₂杂交组合（(subsp. punctatum var. gambia × subsp. purpurascens) × Namangan-77）成功将三个有利等位基因整合入两个鉴定的基因型中。

需要特别指出的是，这些评价专门针对萌发和早期幼苗阶段进行，结果反映了早期分离F₂群体的表现。所选携带全部三个有利等位基因的聚合品系表现出改善的耐盐性（MFV 0.83）、增强的纤维品质（34.4–37.4 g/tex）和高皮棉百分率（39.05%），证明了MAS结合基因聚聚在创建有前景初始育种材料方面的潜力。由于这些F₂群体仍在遗传分离中，观察到的性状稳定性和遗传模式必须在高级世代（F₆–F₇）中加以确认。该育种计划下一步逻辑上包括将这些入选基因型推进至遗传固定，并进行多环境田间试验以验证其在多样农业生态条件下的表现。总体而言，这些发现为旨在增强乌兹别克斯坦盐碱影响地区可持续棉花生产的未来育种计划奠定了宝贵的遗传基础。