开发了一种基于亲和工程改造的受体结合结构域（配体）和人血管紧张素转换酶2（受体）的竞争性侧向流动检测方法，用于广泛检测贝塔冠状病毒（Betacoronavirus）

《Biosensors and Bioelectronics》：Development of a competitive lateral flow assay utilizing affinity-engineered receptor binding domain (ligand) and human angiotensin-converting enzyme 2 (receptor) for broad-spectrum detection on Betacoronavirus

　　

林江|王森|魏文康|法比安娜·比吉|席倩云|张晓艾|张琪|徐秋豪|叶珊珊|龚曦|李世红|费德里科·卡洛斯·布兰科|马里亚诺·拉尔扎巴尔|安赫尔·阿德里安·卡塔尔迪|贝金龙

中国广东省农业科学院农业生物基因研究中心猪禽育种产业国家重点实验室，广州，501640

摘要

新型传染性贝塔冠状病毒对全球公共卫生构成威胁，因此需要快速、广谱的检测方法。传统的抗体依赖性侧向流动测定（LFA）基于特异性免疫识别来检测已知病毒。为了确保能够可靠地检测具有潜在感染风险的各种贝塔冠状病毒，我们开发了一种竞争性LFA系统，该系统使用SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）作为捕获配体，人血管紧张素转换酶2（hACE2）作为受体探针。胶体金颗粒被用来标记hACE2，具有结合活性的RBD在Komagataella phaffii中成功表达并纯化。考虑到RBD中498和501位残基在结合中的作用，引入了多个单突变和双突变。通过分子对接和微尺度热泳技术研究了这些突变的影响，其中Q498Y突变显著增强了与hACE2的结合亲和力。随后的特异性和敏感性分析表明，使用Q498Y RBD的优化检测方法对SARS-CoV-2 S1蛋白的检测限达到1.66 μg/mL。此外，还能够有效检测到其他贝塔冠状病毒，如灵猫源的SARS-CoV和蝙蝠源的RshSTT182/200冠状病毒。这一平台为基于受体-配体的贝塔冠状病毒检测提供了概念验证，可能在即时检测、海关检疫和现场调查中发挥作用。

引言

在过去二十年里，包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2大流行在内的多次贝塔冠状病毒爆发对全球公共卫生构成了持续威胁。其中，SARS-CoV和SARS-CoV-2具有共同的感染机制：它们通过其刺突蛋白与宿主受体人血管紧张素转换酶2（hACE2）结合来启动细胞进入（Hoffmann等人，2020；Wang等人，2020；Yang等人，2023）。SARS-CoV-2通过适应性突变迅速进化，尤其是在其刺突蛋白的受体结合域（RBD）中（例如D614G和N501Y）（Korber等人，2020；Ozono等人，2021；Yurkovetskiy等人，2020）。这些突变增强了与hACE2的亲和力和免疫逃逸能力，从而提高了传播性（Carabelli等人，2023；Kang等人，2021；Shang等人，2020；Starr等人，2020）。这种持续的病毒进化从根本上削弱了依赖于固定抗原-抗体相互作用的检测策略。

目前的冠状病毒即时检测主要使用侧向流动测定（LFAs），这些方法依赖于抗体-抗原识别的特异性（Nguyen等人，2020）。诸如胶体金试纸条之类的格式因其简单性、快速性和低成本而被广泛采用（He等人，2023；Sil等人，2021）。然而，核心靶标（病毒抗原或宿主抗体）可能会发生病毒突变和免疫逃逸（Li等人，2021；Mak等人，2020；Mohammad等人，2023；Peng等人，2022；Salem等人，2022）。因此，为先前变种设计的检测方法可能对新兴毒株的敏感性降低或产生假阴性结果。开发针对保守的病毒进入机制——刺突蛋白-hACE2相互作用的广谱检测方法可能是一个有效的替代方案（Jiang等人，2024）。

基于hACE2的检测概念已经建立，生物物理技术（如表面等离子体共振（SPR）可以精确表征结合亲和力，以评估与新变种相关的传播风险（Basu等人，2020；Higuchi等人，2021；Padariya和Kalathiya，2024；Sehgal等人，2024；Vogel等人，2022）。然而，这些方法需要复杂的仪器和专业知识操作，限制了它们在资源有限的检测环境中的使用，如社区医院或海关检疫（Bastos等人，2023；Du等人，2023）。因此，迫切需要一个方便且易于使用的检测平台，该平台结合了hACE2受体的广谱优势和侧向流动技术的操作简便性、快速性及低成本。

在这项研究中，我们开发了一种新型的竞争性LFA，使用胶体金标记的hACE2和经过亲和工程改造的RBD。该LFA的特异性和敏感性测试证明了其对SARS-CoV-2、SARS-CoV和一种蝙蝠贝塔冠状病毒的交叉识别能力。这一概念验证平台为早期预警具有传染风险的贝塔冠状病毒提供了潜在解决方案，特别是在资源有限的地方。在广谱检测中利用受体-配体识别方法可能为其他病毒的风险评估提供方法学参考。

部分摘录

材料

pcDNA3.4载体（目录编号A14697）和FreeStyle 293-F细胞（目录编号R79007）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Komagataella phaffii X-33菌株（目录编号C18000）和pPICZαA载体（目录编号V195-20）来自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。重组hACE2-His（目录编号2020T13）、hACE2-hFc（目录编号2020T13h）和SARS-CoV S1蛋白（目录编号40150-V08B1）分别来自Sino Biological和Biokangta（中国北京）。重组RBD

竞争性LFA模式的建立和S1蛋白的亲和力表征

我们开发了一种基于胶体金的竞争性LFA试纸条（图1A），利用hACE2受体和病毒S1蛋白之间的特异性识别机制。这种检测模式将病毒目标识别从易突变的抗原-抗体相互作用转变为更保守的受体-配体相互作用，从而为检测病毒突变提供了可能的选择。SPR分析结果显示，S1蛋白以高亲和力与hACE2的细胞外域结合（K_D

结论

在这项研究中，我们概念性地开发了一种基于保守受体-配体识别的新型竞争性LFA。使用hACE2作为受体探针，病毒RBD作为捕获配体，该平台可以处理新兴的未知贝塔冠状病毒，忽略对结合影响较小的突变。为了进一步优化检测性能，我们通过引入突变（Q498Y、N501T和Q498Y/N501T）对RBD进行了合理工程改造，并在K. phaffii中表达。MST验证了

CRediT作者贡献声明

魏文康：形式分析、数据管理、概念化。徐秋豪：数据管理。叶珊珊：研究。张晓艾：方法学、数据管理。张琪：监督、研究。费德里科·卡洛斯·布兰科：验证、方法学。林江：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、形式分析、数据管理。马里亚诺·拉尔扎巴尔：形式分析、数据管理。王森：撰写——初稿、研究、数据管理。龚曦：

未引用参考文献

Ahamad等人，2022年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了Gemini和DeepSeek工具来改进语法和句法。使用这些工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

资助

这项工作得到了特别基金（用于科技创新战略-高水平农业科学院建设（资助编号：NYQS202628）、广东省自然科学基金（资助编号：2021A1515011072）和国家外国专家事务管理局（资助编号：H20240563）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。