麦角硫因对斑马鱼幼体的神经毒性：通过干扰甲状腺功能及诱导神经元凋亡实现

《Chemico-Biological Interactions》：Neurotoxicity of myclobutanil in zebrafish larvae via thyroid disruption and neuronal apoptosis

　　

黄明涛|杨月华|朱建生|刘春兰|朱仁飞

南京医科大学妇女医院产前诊断科，南京妇女儿童医疗保健医院，中国江苏省南京市210004

摘要

戊唑醇（MYC）是一种广泛用于全球农业的系统性合成三唑类杀菌剂。其残留物经常在各种生态系统和生物系统中被检测到。然而，关于其潜在神经发育毒性的研究仍然很少。在这项研究中，斑马鱼胚胎在受精后4至96小时内分别用0、0.5和1毫克/升的MYC处理，以评估其神经毒性作用及其潜在的分子机制。研究结果表明，MYC对胚胎发育产生了不利影响，表现为孵化率降低、存活率下降、心率减慢，同时畸形和自发运动增加。MYC暴露后还观察到了运动功能障碍。MYC还抑制了Tg(HuC:EGFP)斑马鱼的中枢神经系统神经发生，表现为胆碱酯酶活性降低和神经发育相关基因转录减少。此外，MYC扰乱了甲状腺激素平衡，并调节了下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴相关基因的转录谱。分子对接分析表明，甲状腺激素受体β的催化残基与MYC之间存在强烈的结合相互作用。随后，MYC通过上调凋亡基因触发了脑神经元的凋亡。这些神经毒性作用在给予T3后得到了有效缓解，表明甲状腺功能障碍是MYC诱导神经毒性的关键机制。总体而言，本研究揭示了MYC通过干扰甲状腺激素和诱导神经元凋亡在斑马鱼幼体中引起神经毒性的机制，为三唑类杀菌剂的发育神经毒性风险提供了新的见解。

引言

三唑类杀菌剂是现代农业中有效的杀虫剂，用于控制多种作物病害。其中，戊唑醇（MYC）是一种系统性、合成型的广谱杀菌剂，广泛用于防治影响谷物、园艺产品和其他栽培植物的真菌病原体[1]。自1989年首次商业化以来，对MYC的需求持续上升[2]。在中国，MYC长期以来一直被认为是农业实践中控制植物病原体的可靠抗真菌解决方案[3]。

由于MYC具有抗生物降解性、高溶解度、化学稳定性强和吸附能力弱的特点[4][5]，它已成为多种生态系统（如地表水、地下水和土壤）中的普遍环境污染物。在澳大利亚东南部的园艺地区进行的研究记录到，水中MYC的浓度峰值可达2.9微克/升，沉积物中可达120微克/升[6]。同样，在中国沈阳的地表水中，MYC的浓度为3.3 ± 0.8纳克/升，废水样本中的浓度更高（15.2 ± 0.8纳克/升[7]）。特别令人担忧的是，农产品（如婴儿食品）中存在MYC残留，这突显了其在食物链中的生态持久性和生物放大作用[2][8]。最近的一项生物监测研究在非职业暴露人群中检测到人体尿液中的MYC残留，浓度范围从低于检测限到320.7纳克/克肌酐[9]，证实了人类在现实环境中接触该化合物的情况，并强调了评估其潜在健康影响的重要性。

研究表明，MYC对海洋和淡水物种（包括鱼类和贝类）具有多种有害的生态毒性影响，包括神经毒性、发育毒性和内分泌干扰[10][11]。最近的研究强调了三唑类杀菌剂潜在的发育神经毒性问题，这已成为一个特别重要的生态毒性风险。例如，我们之前已经证明丁苯唑会导致斑马鱼的行为异常和神经元模式紊乱[12]。此外，流行病学证据表明，产前或早期接触MYC会增加患自闭症谱系障碍的风险[13][14]，证实神经系统是MYC诱导毒性的敏感靶标。尽管其潜在重要性显著，但目前关于MYC神经毒性作用的实验数据仍然有限，这突显了研究其潜在分子机制和病理过程的必要性。

脊椎动物的神经发育对甲状腺激素（TH）水平非常敏感，无论是异常高（甲状腺功能亢进）还是低（甲状腺功能减退）的浓度都会导致严重的形态和功能缺陷[15]。TH对于正常的神经发育至关重要，它调控神经细胞的增殖、迁移和分化，以及突触形成、髓鞘形成和胶质细胞的发育和功能[16]。大量的实验和流行病学研究已经证实三唑类杀菌剂是普遍存在的环境TH干扰物[17]。戊唑醇会破坏成年斑马鱼的TH稳态，导致其后代的发育异常[18]。我们之前的研究也表明，TH紊乱介导了丁苯唑异构体在斑马鱼中引起的立体选择性心血管毒性[19]。因此，TH紊乱可能是MYC诱导神经毒性的关键机制。

斑马鱼（Danio rerio）是一种有效的神经行为筛选水生模型动物，在神经系统发育方面与人类具有高度遗传和生理相似性，并且对环境TH干扰物具有显著的敏感性[20][21]。在这项研究中，我们研究了Tg(HuC:EGFP)斑马鱼中MYC的神经毒性特性，特别关注TH信号传导功能障碍。基于这一工作假设，本研究揭示了MYC诱导神经毒性的新机制，阐明了TH紊乱在其病理过程中的关键作用，并提供了对其病理作用的新视角。

章节片段

化学物质和试剂

戊唑醇（纯度≥98%）、3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222；纯度≥98%）和T3标准品（纯度≥98%）购自Sigma Aldrich（美国圣路易斯）。胆碱酯酶活性通过ELISA试剂盒（江苏贝泰生物技术研究所）进行分析。甲状腺激素水平使用ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行测定。所有qPCR试剂均购自Vazyme Biotech公司（南京）。

MYC对斑马鱼幼体发育的影响

发育毒性评估表明，MYC损害了斑马鱼的早期生命阶段发育。暴露于1毫克/升MYC的斑马鱼幼体在受精后24小时的存活率降低，孵化延迟（图1A和B），在受精后96小时出现更多的形态异常（图1C），并在受精后48小时出现心动过缓（图1D）。在受精后24小时，虽然未发现显著差异，但检测到自发运动增加（图1E）。

讨论

三唑类杀菌剂在全球农业中广泛用作抗真菌剂，最近有报道称它们与人类神经疾病发病率的增加有关[30]。作为最常用的三唑类杀菌剂之一，MYC的生态毒性效应已被广泛记录[31]。流行病学研究表明，产前接触MYC与儿童自闭症谱系障碍的风险增加有关[13][14]。然而，具体

结论

总之，本研究揭示了MYC通过干扰TH稳态和HPT轴相关基因的功能障碍以及与TRβ的强相互作用，从而诱导神经元凋亡，最终导致斑马鱼的神经发育和神经行为异常。外源性T3的给药通过改善TH紊乱和神经元凋亡缓解了这些不良后果，表明甲状腺紊乱和神经元凋亡是MYC诱导神经毒性的关键机制。

CRediT作者贡献声明

杨月华：撰写 – 审稿与编辑、可视化、资金获取、数据管理、概念构思。朱建生：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据管理、概念构思。黄明涛：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、资金获取、数据管理、概念构思。刘春兰：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资金获取、数据管理、概念构思。朱仁飞：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了江苏省自然科学基金[BK20241103,BK20210037]、江苏省自然科学基金[24KJB330001]、关键实验室开放项目[JSHD202402]、江苏省通过科学技术教育的能力提升项目[ZDXYS202210]、江苏省健康职业学院自然科学基金[JKB202401]以及横向项目[20240007]和关键实验室开放项目的支持