《eBioMedicine》：Implementing portable, real-time 16S rRNA sequencing in the healthcare sector enhances antimicrobial stewardship
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抗菌药物耐药性（AMR）构成了重大的全球性健康挑战，2019年导致超过127万人死亡，预计未来将导致每年多达1000万人死亡。为解决这一问题，医疗领域需要快速（24–72小时）且准确（达到属或种水平）的细菌鉴定方法。研究人员在英国国家医疗服务体系（NHS）内实
抗菌药物耐药性（AMR）构成了重大的全球性健康挑战，2019年导致超过127万人死亡，预计未来将导致每年多达1000万人死亡。为解决这一问题，医疗领域需要快速（24–72小时）且准确（达到属或种水平）的细菌鉴定方法。研究人员在英国国家医疗服务体系（NHS）内实施了基于牛津纳米孔技术（ONT）的16S核糖体RNA（rRNA）测序，以增强诊断能力、减少抗生素滥用并改善患者结局。研究人员采用基于ONT的16S rRNA测序技术，对英格兰柴郡和默西塞德郡七家NHS医院的无菌部位样本（脓液、体液、组织）进行检测。该检测方法经Sanger测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）验证，周转时间为24–72小时。通过追踪数月的抗生素调整情况和患者结局来评估临床影响。ONT 16S测序在56.9%的病例（124/218）中为抗菌药物管理提供了依据。该方法主要用于培养失败（32.1%）或患者已使用抗生素（32.6%）的情况。结果常常证实现有治疗方案（26.6%）或导致无改变（28%），但仍支持靶向处方。链球菌属（Streptococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）是最常检测到的菌属，其中链球菌属在重症监护室（ICU）样本中较为常见。该检测方法对免疫抑制患者的临床影响最大，提高了治疗精确性。将ONT 16S测序整合到常规NHS诊断中，通过提供更快的方法和改进的分类学分辨率，促进了抗菌药物管理。在常规培养可能失败的病例中更早使用该检测方法，可能为抗菌决策提供额外的微生物学信息，并可能减少诊断不确定性。
抗菌药物耐药性（AMR）是21世纪最严峻的健康挑战之一，2019年直接导致127万人死亡，预计未来将攀升至每年1000万例。英国政府已将AMR列为与气候变化、人工智能风险及有组织犯罪并列的四大慢性风险之一。快速精准的诊断是实现抗菌药物管理（antimicrobial stewardship）的首要步骤，但传统培养方法对苛养菌或生长缓慢菌不敏感，且分子检测限于特定病原体。在此背景下，研究人员开展了基于牛津纳米opre技术（ONT）的全长16S rRNA测序临床验证与应用研究，论文发表于《eBioMedicine》。
本研究旨在英国国家医疗服务体系（NHS）多医院场景中实施便携式、快速的16S rRNA测序技术，以弥补传统诊断方法的不足，促进抗菌药物合理使用。研究人员开发并验证了一套 turnaround time（TAT）为24–72小时的检测流程，通过精益细菌诊断（lean bacterial diagnosis）理念优化临床路径，最终证实该技术能显著影响抗菌药物决策，尤其对免疫抑制患者具有重要临床价值。
研究样本来源于英格兰柴郡和默西塞德郡七家NHS医院的无菌部位样本，包括脑脊液（CSF）、关节液、其他体液、组织、脓液/脓肿、血培养、拭子等，共收集218份样本，涉及188例患者。样本覆盖急性综合医院及神经专科、外科、肿瘤专科、儿科等专科医院。
关键技术方法包括：基于ONT的纳米孔测序平台，采用16S Barcoding Kit（BC1-14）SQK-16S024试剂盒及R9.4.1流动池（FLO-MIN106）进行测序；生物信息学分析采用NanoFilt进行质量过滤（阈值Q12、850–1500 bp），Kraken2结合Greengenes数据库进行分类学注释，amplicon_sorter生成一致性序列后通过BLAST比对rRNA/ITS数据库；验证阶段与Sanger测序、MALDI-TOF及外部质量评估（EQA）机构QCMD的结果进行交叉比对；临床影响通过回顾性审查病历，记录抗生素调整（升级/合理化/无变化）进行评估，采用Logistic回归分析免疫状态、年龄、性别与抗菌药物管理结局的关联。
**检测结果与临床影响**
**检测验证准确性与技术改进**：109份验证样本全部与QCMD预期结果或既往结果一致（总体一致性100%），包括一例先前Sanger测序因混合菌落报告"无法测序"的样本（肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae和鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii），ONT成功区分两种病原体。8例Sanger测序失败的样本经ONT检测与培养+MALDI-TOF结果匹配。24例参考实验室报告阴性的样本中，21例与ONT结果一致，3例检测到细菌DNA（包括一例脑脊液中的梭杆菌属Fusobacterium sp.和两例体液中的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）。此外，ONT能从16S单一基因鉴定出参考实验室靶向PCR报告的病原体，并额外识别三种共生菌或潜在病原体。
**患者与样本特征**：样本来源以住院患者为主（71.9%），其次为门诊（15.0%，主要集中于眼科）和重症监护室（ITU；13.0%）。患者年龄中位数59岁（IQR：34.5–69），50–69岁年龄组占比最高（81例）。男性107例（56.9%），女性81例（43.1%）。免疫状态方面，免疫正常141例（75.0%），免疫抑制22例（11.7%），25例信息缺失。
**16S测序有效解决培养阴性病例并优化抗菌治疗**：请求16S检测的首要原因是培养失败（32.1%），其次为采样时已使用抗生素（32.6%）。其他原因包括确认非感染性病因（5.0%）、怀疑苛养菌（4.1%）、担忧周转时间（3.7%）等。临床结局方面，"无变化"占28.0%，"确认当前治疗方案"占26.6%，"停用抗生素"占16.5%，"更换抗生素"占8.3%，"确认非感染性病因"占3.7%，"启动抗生素治疗"占1.4%等。综合而言，16S结果直接或间接促进抗菌药物管理的比例为56.2%（升级9.63%+合理化47.25%）。
**链球菌属和葡萄球菌属为主要检出菌属，链球菌属与住院相关性强**：链球菌属是最常检出的菌属，在重症监护室样本中占33.3%，在住院 wards占15.4%。葡萄球菌属仅见于ward样本（7.7%）。菌种分布与样本类型和患者位置相关：痤疮Cutibacterium在重症监护室和组织样本中占比高（各16.7%），在关节液中占25.0%，在脓液/脓肿中占21.4%；梭杆菌属在各类位置和样本中均有检出；分枝杆菌属Mycobacterium和微小单胞菌属Parvimonas仅见于门诊样本。链球菌属在脑脊液（28.6%）和体液（37.5%）中占比最高，亦见于血培养（20.0%）、拭子（33.3%）和脓液（14.3%）。
**16S测序对免疫抑制患者抗菌药物管理影响最大，年龄和性别无显著关联**：124/218例（56.9%）样本对抗菌药物管理产生贡献，其中升级21例、合理化103例。免疫抑制患者获得管理干预的比值比（OR）显著高于免疫正常患者（OR=2.99，95% CI [1.11–9.50]，p=0.04）。年龄（OR=1.00，95% CI [0.98–1.01]，p=0.68）和性别（OR=0.85，95% CI [0.47–1.54]，p=0.60）与抗菌药物管理无显著关联。多项Logistic回归分析显示类似趋势：免疫抑制患者升级治疗的OR显著升高，合理化治疗的OR亦呈升高趋势但未达统计学显著性。
**讨论部分总结**
研究人员成功将ONT 16S测序整合为NHS认证检测项目，实现了24–72小时的快速周转，较既往约7天的Sanger方法显著缩短。该技术的核心优势在于可一次性测序完整16S基因，无需序列拼接，且在保持可靠性的同时提升检测灵敏度——不仅能鉴定到种水平，还能检测混合感染中的多种病原体，并识别传统方法漏检的细菌DNA。临床审查流程（由微生物学顾问结合临床情境和常规培养结果复核）有效避免了定植菌的误判风险。
研究局限性包括：16S rRNA测序无法提供抗菌药敏信息，未来需结合全基因组测序或鸟枪法宏基因组学检测耐药基因；研究为描述性实施研究，无对照组，不能确立因果关系；免疫状态关联的置信区间较宽，反映样本量限制；未对医院层级聚效应进行建模。
**研究结论**：优化后的ONT 16S工作流为细菌鉴定提供了一种敏感、特异且快速的方法，成功克服了传统Sanger方法的局限，已成为常规诊断工具的重要组成部分。该技术通过促进抗菌药物升级或合理化，在56.2%的病例中影响临床决策，尤其对免疫抑制患者价值显著。未来将进一步优化不同样本类型的应用，并探索在培养高风险失败场景中的早期应用策略。
