基于生物活性的沙棘黄酮提取方法及其对β-半乳糖苷酶活性的增强作用：一种用于抗衰老功能性食品成分的加工策略

《Enzyme and Microbial Technology》：Bioactivity-oriented extraction of sea buckthorn flavonoids with enhanced β-galactosidase inhibition: A processing strategy for anti-aging functional food ingredients

　　

崔明荣|黄雅茹|陶彦春|张颖|赵秀华|陈晓强

中国黑龙江省哈尔滨市东北林业大学化学、化学工程与资源利用学院，邮编150040

摘要

与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gla）是细胞衰老和老化的重要酶学生物标志物，因此抑制其活性成为开发抗衰老功能性食品的有前景策略。沙棘（Hippophae rhamnoides L）果实富含具有抗氧化和抗衰老作用的黄酮类化合物；然而，传统的提取方法更注重产量而非保留生物活性。在本研究中，我们采用以β-Gla抑制活性为导向的提取策略（Bioactivity-Oriented, BO），并通过响应面方法优化了超声辅助的酶法提取过程。在最佳提取条件下，β-Gla的抑制率达到了74.71?±?1.88%。纯化后的BO提取物中主要黄酮类化合物（芦丁、山柰酚和异鼠李素-3-O-芦丁苷）的含量显著高于以产量为导向的YO提取物（分别为54.0%和27.5%）。因此，纯化的BO提取物表现出更强的抗氧化活性和β-Gla抑制能力（IC?? = 30.33?μg/mL），而YO提取物的IC??为47.62?μg/mL）。相关性分析表明，这种增强的生物活性是由于多种黄酮类化合物之间的协同作用。这些发现表明，BO策略能够选择性富集高活性黄酮成分，为生产具有靶向抗衰老特性的沙棘衍生成分提供了有效的加工方法，适用于功能性食品。

引言

衰老是一个全球性的健康挑战，主要由与细胞衰老相关的标志物异常激活所驱动。与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gla）活性升高是衰老的关键标志物[1]。β-Gla活性的增加会加速衰老细胞的积累，从而导致骨关节炎和慢性炎症等与年龄相关的疾病[2]。这种积累主要是由于β-Gla在溶酶体内的积累[3]。因此，通常使用体外β-Gla抑制实验来筛选潜在的抑制剂。β-Gla活性也与细胞内氧化应激的增加呈正相关。氧化应激产生的过量活性氧（ROS）会加剧衰老过程并加重氧化损伤[4]、[5]。有效的抗氧化剂通过清除ROS和修复氧化损伤途径来降低β-Gla活性，从而有助于减少衰老细胞的积累，延缓组织老化和疾病进展[6]、[7]。值得注意的是，针对β-Gla的前药可以消除衰老的软骨细胞，并延缓老年小鼠的骨关节炎进展[8]。因此，从天然产物中鉴定更有效的β-Gla抑制剂和抗氧化剂对于抗衰老干预至关重要[9]。

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）因其药用和营养价值而受到重视，尤其是其抗氧化、抗癌、保肝、护肾和心血管保护作用[10]、[11]。其果实中的黄酮类化合物主要是黄酮醇苷，如槲皮素、异鼠李素和山柰酚，以及它们的糖基化衍生物[12]。这些活性，尤其是抗氧化作用，与涉及β-Gla异常激活的衰老过程密切相关[4]、[5]，使得沙棘成为潜在的β-Gla抑制剂来源。

大多数关于天然产物提取的研究都集中在优化工艺参数以最大化产量和增强目标成分的含量[13]、[14]。然而，之前对金银花、大黄叶、荷叶等天然产物的研究强调了以生物活性为导向（Bioactivity-Oriented, BO）提取策略的重要性。这种方法旨在富集高活性成分，如黄酮类[15]、[16]。例如，Tian等人[16]使用BO策略鉴定了关键活性成分（如槲皮素和核黄素），并优化了提取条件，提高了产品的抗氧化和黄嘌呤氧化酶抑制（XOI）活性。然而，关于沙棘黄酮的研究主要集中在以产量为导向（Yield-Oriented, YO）的工艺优化上[17]、[18]。目前尚未有研究采用以抗衰老活性为导向的提取策略。这两种提取策略对成分和活性的影响尚不清楚，限制了从沙棘中筛选和应用抗衰老黄酮类化合物。

在本研究中，β-Gla抑制活性是主要的响应变量。通过响应面方法（Response Surface Methodology, RSM）优化了超声辅助的酶法提取沙棘黄酮类化合物，随后使用AB?8大孔树脂进行纯化。通过HPLC分析了黄酮类化合物的组成，以确定具有β-Gla抑制作用的成分。还评估了提取物的体外抗氧化能力，以考察其与β-Gla抑制作用的相关性。这项研究有助于提取高活性黄酮化合物并筛选天然β-半乳糖苷酶抑制剂。

章节片段

材料与化学品

沙棘果实分别购自中国吕梁（小果型，样品1）、阿尔泰（大果型，样品2）和大兴安岭（大果型，样品3）。这些果实由东北林业大学的陈晓强教授鉴定为Hippophae rhamnoides。果实经过60°C干燥、研磨、60目筛分后，储存在?20°C条件下。

纤维素酶（10,000 U·g?1）和果胶酶（100,000 U·g?1）购自Macklin Biotechnology Co., Ltd。芦丁的纯度≥97%

结果表明，三种沙棘品种在总黄酮（TF）产量和β-Gla抑制活性方面存在差异（表1）。来自山西吕梁的小果型沙棘具有最高的TF产量（15.58?±?0.66?mg/g）和最强的抑制活性（72.13?±?0.89%）。由于其独特的生长环境和遗传特性，小果型沙棘可能含有比大多数大果型品种更高的黄酮含量，并积累更多的生物活性黄酮

结论

本研究开发了一种以β-Gla抑制为目标的沙棘黄酮提取策略（BO）。来自山西吕梁的小果型沙棘被证明是制备高活性黄酮产品的优良原料。通过优化酶的比例、酶解时间和乙醇浓度，BO策略显著增强了β-Gla的抑制活性。纯化后，主要黄酮类化合物（如芦丁、山柰酚和异鼠李素-3-O-芦丁苷）得到富集，并表现出较强的抑制效果

黄雅茹：研究监督、方法学设计、实验实施。陶彦春：数据可视化、实验分析。张颖：论文撰写与修订、研究监督、方法学设计、资金申请。赵秀华：数据可视化、实验分析、数据管理。陈晓强：论文撰写与修订、研究监督、资金申请、数据管理、概念构思。崔明荣：论文初稿撰写、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。

作者声明没有利益冲突。

本研究得到了宁夏回族自治区自然科学基金（项目编号：2025AAC031046）、黑龙江省自然科学基金（项目编号：LH2024C034）、新疆维吾尔自治区重点研发计划（项目编号：2024B04038）、西藏农牧大学第七批柔性引进人才计划（项目编号：NYRXRC?2023–01）、东北林业大学种子产业创新项目的支持