一种新的双位点基因分型方法揭示集约化猪场中Balantioides coli的流行病学特征

《Food and Waterborne Parasitology》：A novel dual-locus genotyping approach reveals epidemiological characteristics of Balantioides coli in intensive pig farms

　　

Balantioides coli是一种重要的人兽共患寄生性原生动物（zoonotic parasitic protozoan），猪是其保虫宿主（reservoir host）。有限的分子分型工具（molecular typing tools）阻碍了研究人员对其在集约化养猪中传播和遗传变异（genetic variability）的理解。在本研究中，研究人员分两批从三个集约化猪场采集了1251份猪粪便样品。开发并应用了一种基于β-微管蛋白基因（β-tubulin）和内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）的双位点分子分型方法（dual-locus molecular typing method），以分析B. coli的流行病学特征（epidemiological characteristics）和遗传变异。结果显示总感染率为87.7%（1097/1251），呈现年龄依赖模式（age-dependent pattern），1–2月龄仔猪感染率较低，随后在3–4月龄迅速升高，到5–6月龄接近100%。基于β-tubulin基因的系统发育分析（phylogenetic analysis）划分出三种单倍型（haplotypes I、II和III），确认了先前鉴定的ITS序列变异体（sequence variants）A和B，并进一步解析了新的序列变异体C。单倍型和序列变异体的表达呈现明显的地理分布模式（geographical distribution pattern），单倍型I和变异体A主要集中在浙江地区，而单倍型III和变异体C在猪中检测到且仅在该地区发现。这些发现表明，在集约化高密度饲养条件下，B. coli传播高度流行，且某些序列变异体的分布存在地理聚集性（geographical clustering），这可能反映了当地的生态或养殖管理因素。本研究为阐明集约化养殖系统中B. coli的传播机制提供了重要的双位点基因分型见解（dual-locus genotyping insights）。

论文解读文章

研究背景与意义：Balantioides coli（旧称Balantidium coli）是一种被忽视的人兽共患寄生性原生动物，宿主范围广泛，主要以猪和非人灵长类动物为保虫宿主。该寄生虫感染在人类主要表现为痢疾，亦可引起腹腔、泌尿生殖道和肺部等肠外感染；在猪群中通常引起亚临床感染，但在集约化养殖条件下可成为机会性病原体，导致黏膜溃疡、痢疾和生长迟缓，造成显著经济损失。目前，关于B. coli的研究未获广泛关注，可用数据稀少。传统诊断方法（如漂浮法和沉淀法）存在灵敏度低、无法分析遗传特征、难以区分形态相似病原体等局限。基于小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）和内转录间隔区（ITS，包括ITS1–5.8S rRNA-ITS2区域）的分子诊断方法已建立，SSU rRNA可用于种特异性鉴定，ITS序列分析可区分两种序列变异体（A和B）。然而，ITS区域为非编码多拷贝序列，单个细胞内可能共存多种变异体，PCR检测到的优势变异体未必代表分离株的全部遗传信息；且其高突变率在深层进化推断中易造成混淆。先前研究基于β-微管蛋白基因（β-tubulin）开发了新的分子分型工具，显示出比传统ITS标记更高的分型分辨率和遗传多态性。因此，本研究创新性地将β-tubulin与ITS标记联合，以提高B. coli鉴定的准确性和可靠性。在集约化封闭式养殖系统下，粪-口传播寄生虫的传播速率显著升高，防控难度加大。本研究旨在通过β-tubulin-ITS双标记基因分型方法，调查集约化猪场不同月龄猪群中B. coli的感染率、序列变异体分布模式及遗传变异，为风险评估提供依据。论文发表在《Food and Waterborne Parasitology》。

主要关键技术方法：本研究建立了基于β-tubulin基因和ITS基因的双位点分子分型方法。样品来源：于2024年10月至2025年3月，分两批次从中国三个集约化猪场（分别标注为HN-1、HN-2和ZJ，对应河南驻马店、河南信阳和浙江衢州）共采集1251份新鲜猪粪便样品。第一批次382份样品按1–6月龄每年龄组约20份、每栏一份以保持独立性系统采集；第二批次869份样品在HN-1和HN-2补充采集，覆盖相同年龄范围但允许每栏多份样品随机采样。记录每份样品的来源农场、月龄和栏号。采用PCR扩增ITS区域（引物B5D/B5RC）和β-tubulin基因（巢式PCR，引物F1/R1及F2/R2）进行分子检测。阳性扩增产物经Sanger测序，对第一批次样品按年龄组每农场均选5份阳性样品进行双位点测序。用Clustal X 2.1比对序列，MEGA X构建最大似然系统发育树（GTR模型，1000次自举检验），iTOL平台可视化。统计分析使用SPSS 25.0的卡方检验（P<0.05为显著）。

研究结果：

3.1 测序结果：通过ITS和β-tubulin双位点检测，1251份样品中1097份（87.7%）为B. coli阳性。β-tubulin位点检出955份阳性（76.3%），ITS位点检出1007份阳性（80.5%）。基于β-tubulin鉴定出三种单倍型：单倍型I（n=24）、单倍型II（n=70）和单倍型III（n=3），单倍型II在所有年龄组中占优势，单倍型I仅在ZJ地区检出。ITS序列变异体B（n=75）为优势变异体，变异体A（n=19）零星分布，变异体C（n=2）仅在ZJ地区检出。感染率在3、5、6月龄猪群中达100%（HN-1和HN-2），感染率与年龄显著相关（χ²=24.296，p<0.001）。农场间感染率差异极显著（χ²=2502.00，p<0.001）。

3.2 第一批次调查中B. coli感染情况：382份样品总感染率为83.2%。在HN-1和ZJ地区观察到一致的年龄相关感染模式：1–2月龄仔猪感染率低，3–4月龄迅速升高，5–6月龄持续高感染。感染率最低在1月龄（HN-1为45.8%，ZJ为35.0%）。区域动态显示：HN-1早期持续高感染，3月龄达100%；HN-2早期波动（1–4月龄50.0%–91.7%），5–6月龄稳定至100%；ZJ稳定递增（1月龄35.0%升至6月龄95.0%）。ITS和β-tubulin双位点检测结果高度一致。ITS位点中变异体B在各年龄组占优势，变异体A在ZJ地区5月龄猪中聚集（9/19），变异体C仅在1月龄猪中检出。β-tubulin位点单倍型II在HN-1和HN-2占优势，单倍型I主要在ZJ地区（15/24），单倍型III（3/3）仅见于ZJ。

3.3 第二批调查中B. coli感染情况：第二批869份样品总感染率为89.6%（779/869），HN-1为88.9%（424/477），HN-2为90.6%（355/392）。最低感染率在1月龄（HN-1为39.7%，HN-2为76.7%）。2月龄起迅速上升，5–6月龄接近或完全100%。ITS和β-tubulin总体阳性率分别为81.9%（712/869）和77.1%（670/869）。在HN-1的3月龄猪中，ITS阳性率100%而β-tubulin仅82.3%。

3.4 B. coli分离株的系统发育关系：对64份双位点均测序成功的样品进行系统发育分析。ITS系统发育树分为三个进化支：序列变异体A、B和C。变异体A与参考序列（PP761305、OR397820、JF444759）聚类；变异体B与ON391580、ON391583形成独立分支；变异体C（仅有1194和1195两个分离株）形成高支持率独立进化支（bootstrap 98%）。β-tubulin系统发育树将分离株分为三个高支持率单倍型（I、II、III）。单倍型I与PV609780紧密聚类；单倍型II包含PV609776；单倍型III包含PV609778和PV609777。

讨论总结：本研究利用新型双位点方法（β-tubulin+ITS）调查了三个集约化猪场的B. coli感染率，发现极高感染率（87.7%）和年龄依赖模式。β-tubulin系统发育将分离株分为三种单倍型，首次在猪源B. coli中检测到单倍型III（此前仅报道于豚鼠），提示该β-tubulin序列变异体并非严格宿主特异性。感染率高于多数既往报道（巴西27.5%、韩国64.7%等），但低于印度93.0%和意大利92.4%，表明非洲猪瘟背景下集约化高密度封闭养殖促进了传播。年龄依赖模式（1–2月龄低、3–4月龄升高、5–6月龄近100%）在两次批量中一致验证。双位点策略提高了诊断准确度：单一位点可能低估感染率（第一批中有56份仅一位点阳性）。ITS检出率（80.5%）高于β-tubulin（76.3%），可能因rRNA基因簇多拷贝提高了PCR灵敏度。64份分析中57份符合变异体A/单倍型I、变异体B/单倍型II的对应模式；2份分离株属变异体C，且可能与β-tubulin单倍型III相关（仅基于2个样品）。7份分离株出现分型不一致，可能源于不同基因座进化速率与选择压力差异或遗传重组。B. coli单倍型分布呈现明显地理模式：单倍型I主要集中于ZJ（15/24），单倍型III仅在该地区检出；ITS变异体A在ZJ频率最高（12/19），变异体C仅见于ZJ。这种聚集分布表明地理隔离或当地养殖生态系统形成了独特的种群结构。单倍型III和变异体C首次在猪中检出，可能代表新近出现的本地单倍型或由其他动物宿主（如豚鼠）跨种传播引入。

研究结论：本研究利用靶向β-tubulin和ITS基因的新型双位点基因分型方法，调查了中国集约化猪场的B. coli感染。对1251份粪便样品的分析显示总感染率高达87.7%，感染率随月龄增加，在5–6月龄猪中接近100%。遗传测序鉴定出三种β-tubulin单倍型（I、II、III）并检测到ITS序列变异体A、B和C（变异体C此前报道于豚鼠）。单倍型和序列变异体的分布呈现地理模式，单倍型I/变异体A占优势，单倍型III/变异体C仅在浙江地区检出。这些发现表明，集约化养殖条件下B. coli传播广泛，且某些序列变异体的分布存在地理聚集性，可能反映当地生态或养殖管理因素。