基于施万细胞脱细胞基质(acellular matrix, ACM)的3D生物打印支架用于下牙槽神经(Inferior Alveolar Nerve, IAN)再生研究

《ACS Omega》：Development of Acellular Matrix-Based Bioprinted Scaffold for Inferior Alveolar Nerve Regeneration

　　

下牙槽神经（Inferior Alveolar Nerve, IAN）是下颌神经的感觉支，支配牙齿、颏部及下唇的感觉。IAN损伤常由创伤或医源性因素引起，导致进食困难、微笑障碍、疼痛及感觉异常等症状。由于IAN走行于下颌骨管内，其再生受到限制，现有的药物及手术干预仅能提供部分恢复。因此，研究人员开发了由藻酸盐(alginate)、甲基纤维素(methylcellulose, MC)及施万细胞来源脱细胞基质(Schwann cell-derived acellular matrix, Alg/MC/ACM)组成的3D生物打印支架用于IAN再生。Alg/MC水凝胶具有良好的机械稳定性和可打印性，ACM提供神经再生的生物信号。蛋白质组学分析显示施万细胞裂解物与ACM中存在904种共有蛋白。流变学分析证实Alg/MC/ACM水凝胶具有剪切变稀(shear-thinning)及粘弹性(viscoelastic)特征。以大鼠施万细胞(RSC96)和神经元细胞(PC12)进行的体外细胞相容性测试(MTT及Live/Dead assay)表明，含10 μg/mL ACM的Alg/MC/ACM2支架相比Alg/MC及Alg/MC/ACM1(含1 μg/mL ACM)支架显著促进细胞增殖与活力。SD大鼠IAN挤压伤(crush injury)模型体内实验显示，植入Alg/MC/ACM2支架较损伤对照组改善行为学反应，并促进细胞浸润、轴突有序排列及再髓鞘化(remyelination)，经苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)染色及快蓝(Luxol Fast Blue, LFB)染色证实。综上，在Alg/MC支架中引入施万细胞来源ACM可提供促神经再生的生物活性微环境。本研究首次证明Alg/MC/ACM生物打印支架作为IAN修复潜在治疗策略的价值。

论文解读：基于施万细胞脱细胞基质生物打印支架的下牙槽神经再生研究

《ACS Omega》刊载的该研究针对下牙槽神经(Inferior Alveolar Nerve, IAN)损伤后再生困难这一临床难题展开。IAN走行于狭窄的下颌管中，损伤后施万细胞(Schwann cell)及巨噬细胞浸润受阻，神经营养因子扩散受限，加之术后纤维化及胶质瘢痕形成，导致自发再生极差，现有药物及手术手段疗效有限。既往生长因子(growth factor)直接递送策略因半衰期短、扩散快且缺乏局部缓释而受限。为此，研究人员提出将施万细胞来源脱细胞基质(Schwann cell-derived acellular matrix, ACM)掺入藻酸盐(alginate)-甲基纤维素(methylcellulose, MC)复合水凝胶中，通过3D生物打印构建兼具结构支撑与生物活性信号传导功能的支架(Alg/MC/ACM)，以促进IAN挤压伤后的轴突再生与再髓鞘化(remyelination)。

主要关键技术方法：

研究人员采用RSC96大鼠施万细胞制备并纯化ACM；通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质组学鉴定与比对；配制含不同浓度ACM(1 μg/mL及10 μg/mL，分别标记为Alg/MC/ACM1及Alg/MC/ACM2)的Alg/MC水凝胶，利用流变仪测定剪切变稀及储能模量(G′)、损耗模量(G″)；使用挤出式3D生物打印机(Cellink Inkredible+)打印网格支架并经氯化钙二步交联；通过MTT法及Live/Dead荧光染色评估RSC96与PC12细胞在支架上的增殖与活力；建立SD(Sprague-Dawley)大鼠IAN 30秒止血钳挤压伤模型，植入Alg/MC/ACM2微型支架，术后21天进行改良von Frey刷刺激行为学评估，取神经组织行苏木精-伊红(H&E)染色及Luxol Fast Blue(LFB)髓鞘染色观察再生情况。

研究结果：

3.1. 蛋白质组学分析(Proteomic Analysis of ACM)：

研究人员通过LC-MS/MS从ACM中鉴定出1451种蛋白，施万细胞裂解物(cell lysate, CL)鉴定出1215种蛋白，两者共有904种蛋白。基因本体论(Gene Ontology, GO)富集分析及STRING蛋白互作分析显示ACM蛋白富集于胞内区域、蛋白结合、激酶结合等功能条目，涉及代谢过程及细胞功能通路，证实ACM保留了施万细胞源基质的关键结构及信号蛋白。

3.2. 流变学表征与生物打印(Rheological Characterization and Bioprinting)：

所有水凝胶均表现出剪切变稀行为(粘度随剪切速率增加而降低)。纯藻酸盐水凝胶在低剪切应力(~10 Pa)即发生G′与G″交叉(由类固态转为类液态)，而Alg/MC复合材料将交叉点推迟至~100 Pa，显示更好的抗变形能力与打印稳定性。掺入ACM(1或10 μg/mL)不改变Alg/MC的粘度及G′、G″。研究人员成功打印出10×10×1.2 mm网格支架，形状保真度良好。

3.3. 溶胀与降解分析(Swelling and Degradation Analysis)：

Alg/MC及Alg/MC/ACM组初期(0.5 h)溶胀率显著高于纯藻酸盐组(p<0.05)，24 h达约290%~305%，ACM的加入未明显改变溶胀比。四组支架在PBS中180天降解率均为约50%~60%，降解模式相似，表明ACM不影响水凝胶网络的水解/离子交换行为。

3.4. 细胞活力与增殖(Cell Viability and Proliferation)：

MTT结果显示纯藻酸盐组施万细胞增殖随时间下降。Alg/MC与Alg/MC/ACM1组增殖在第7天升高但第14天回落；Alg/MC/ACM2(10 μg/mL ACM)组从第7天起持续显著增高细胞增殖(p<0.001)，第14天达最高且优于其他组。PC12神经元细胞呈相同趋势。Live/Dead染色显示Alg/MC/ACM2中包埋的RSC96细胞培养7天后绿色荧光(活细胞)占主导，确认生物打印过程及交联未损细胞活力。

3.5. 体内动物实验(In Vivo Animal Studies)：

SD大鼠IAN挤压伤模型植入Alg/MC/ACM2支架。术后21天行为学测试显示：损伤对照组对患侧机械刺激反应微弱或无撤头/闭眼反射，而Alg/MC/ACM2治疗组出现明确头部及眼部运动，接近对侧正常水平。组织学示：损伤对照组见组织紊乱无髓鞘；Alg/MC组仅见轻度细胞浸润伴纤维化，LFB染色阴性；Alg/MC/ACM2组见纵行排列密集细胞及均匀LFB阳性(蓝色)髓鞘染色，提示轴突重组与再髓鞘化。

讨论与结论翻译总结：

研究人员指出，IAN损伤是口腔颌面外科常见并发症，下颌第三磨牙拔除术中发生率约0.35%~8.4%。3D生物打印可实现支架架构与生物活性组分的空间控制，ACM保留了多种促神经再生的胞外基质蛋白及潜在神经营养因子。本研究证实ACM以10 μg/mL掺入Alg/MC不影响其流变学性能及打印性，且Alg/MC/ACM2支架在体外显著增强施万细胞与神经元增殖，在大鼠IAN挤压伤体内模型中恢复感觉反应并促进髓鞘形成。游离ACM因在下颌骨管内易扩散清除未被采用，支架可提供局部缓释微环境。局限包括未进行神经传导速度(electrophysiology)测定及更宽ACM浓度梯度筛选，将在后续研究中开展。结论为：Alg/MC/ACM生物打印支架是一种有前景的IAN再生生物活性平台，其中10 μg/mL ACM为诱导再生的最小有效剂量，首次证明了此类支架用于IAN修复的潜力。