综述：在碱基之间阅读：RNA修饰检测的技术进展

《Frontiers in RNA Research》：Reading between the bases: technological advances in RNA modification detection

　　

尽管表观转录组学（epitranscriptomics）迅速扩展，但准确检测和定位RNA修饰（RNA modifications）仍然是一个主要的技术挑战，限制了研究人员对其功能及治疗相关性的理解。目前已鉴定出超过170种化学RNA修饰，这些修饰通过动态调控RNA加工、稳定性、定位和翻译，共同塑造了表观转录组（epitranscriptome）。其中，m⁶A、m⁵C、假尿苷（Ψ）、m¹A、m⁷G、2′-O-甲基化（2′-O-Me）和A-to-I编辑（A-to-I editing）是特征最明确的修饰，并已成为影响广泛细胞功能的RNA关键调控因子，其失调与多种疾病密切相关。针对表观转录组通路（尤其是癌症）的治疗兴趣日益增长，加剧了对稳健、定量且修饰特异性检测策略的需求。在这篇小型综述中，研究人员批判性地考察了当前用于表观转录组分析的主要技术，包括基于免疫沉淀的测序（immunoprecipitation-based sequencing）、化学和酶学探针（chemical and enzymatic probing）、RNA质谱（RNA mass spectrometry）以及直接RNA测序（direct RNA sequencing）。研究人员没有将这些方法视为孤立的方法论，而是强调了用于跨不同RNA修饰类别进行严格表观转录组定位所需的方法论互补性。尽管每种方法都在分辨率、通量和系统偏差之间进行权衡，但整合了天然多模态测序（native multimodal sequencing）、正交化学反应性（orthogonal chemical reactivity）和遗传验证（genetic validation）的混合策略正在提高检测准确性和特异性。在化学计量定量、稀有修饰检测和因果推断方面仍存在持续挑战，但人工智能驱动的从头检测（AI-driven de novo detection）的新兴进展可能克服这些限制。结合单细胞空间转录组学（single-cell spatial transcriptomics）和大规模CRISPR-表观转录组筛选（CRISPR-epitranscriptomic screening）的进展，这些技术有望加速RNA修饰的功能解码及其向治疗应用的转化。

**Introduction**
RNA的化学修饰构成了转录组后转录调控的动态调控层，类似于表观基因组，通过精细调控所有亚型编码和非编码RNA的功能、加工、稳定性及翻译，对生理和病理细胞稳态产生深远影响。特定酶（称为表观转录组写入因子（epitranscriptomic writers））如METTL3（m⁶A）、NSUN2（m⁵C）、PUS酶（Ψ）、TRMT61（m¹A）、METTL1（m⁷G）、FBL（2′-O-甲基化）和ADAR脱氨酶（A-to-I编辑）转录后将这些标记安装在RNA上，通常与非催化亚基协作以确保有效靶标识别并增强酶活性。RNA修饰可通过塑造RNA一级和二级结构直接发挥作用，或通过决定RNA命运的阅读因子（reader proteins）间接施加影响。这些转录后修饰在细胞RNA上建立的复杂表观转录组编码（epitranscriptomic code）是细胞稳态所必需的，其失调与包括癌症、神经发育障碍在内的疾病强相关。多数RNA修饰在五十多年前通过低通量方法如薄层色谱和质谱被识别，但这些技术仅提供有限的功能见解，不足以进行全面转录组分析。随后，下一代测序（next-generation sequencing, NGS）的出现通过互补策略实现了转录组规模的表观转录组定位。首先，利用修饰特异性抗体，开发了基于抗体的免疫沉淀（MeRIP-seq）以富集修饰RNA并进行测序，生成了首个m⁶A转录组图谱。同时，结合化学衍生方法（如亚硫酸氢盐RNA-seq、Pseudo-seq）和逆转录签名分析的技术被开发用于识别特定修饰如m¹A、假尿苷和m⁵C。这些方法共同生成了基础性表观转录组图谱，揭示了特定RNA亚型内特征性修饰模式和环境依赖性动态。然而，这些进展受到抗体特异性、间接读出偏差、逆转录酶伪影和分辨率限制等根本性约束，导致假发现率升高并影响准确的化学计量量化。为部分克服这些问题，特异性对照如酶缺失和使用正交方法允许开发高置信度表观转录组数据集。随后，混合方法如miCLIP提高了特异性和分辨率。第三代纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies, ONT）通过直接测序天然RNA而无需逆转录或扩增，颠覆了这一范式。通过利用修饰诱导的离子电流信号扰动，经机器学习框架（如xPore、EpiNano、CHEUI）解码，纳米孔测序有望在单分子高分辨率下进行定量检测，并具有固有的多模态能力。纳米孔直接RNA测序碱基识别器目前已包含5种修饰的识别：m⁶A、肌苷、m⁵C、假尿苷和2′-O-核糖甲基化。然而，修饰诱导信号的有限强度和当前分析流程的巨大计算需求表明，纳米孔测序单独使用时是一个渐进而非变革性的进步，其全部潜力通过整合正交化学和遗传验证策略得以最佳实现。这篇小型综述摒弃以修饰为中心，采用技术聚焦的框架，批判性评估当前方法在m⁶A、m⁵C、Ψ、m¹A、m⁷G、2′-O-Me和A-to-I编辑中的核心优势、实际局限和应用，强调方法学整合如何弥补个体不足。通过严格剖析关键权衡，研究人员认为混合方法是一种方法论上的必要而非便利，如纳米孔-质谱（nanopore-MS）工作流程显著降低假发现率并能够解析指示组合性表观转录组编码的共现模式。尽管在测量低化学计量事件、检测稀有修饰和建立因果关系方面存在持续挑战，本分析概述了实现解码RNA化学语法并奠定治疗开发基础的综合表观转录组图谱的可行路径。

**Immunoprecipitation-based sequencing**
特异性RNA免疫沉淀结合NGS测序成为高通量表观转录组学的主要方法，利用修饰特异性多克隆和单克隆抗体的可用性。这些工具用于在NGS短读段测序前选择性富集携带特定修饰的RNA片段。通过将RNA片段化为100–200核苷酸片段，IP-seq生成覆盖修饰景观的广泛图谱。对于N⁶-甲基腺苷（m⁶A），MeRIP-seq和m⁶A-seq建立了基础性图谱，记录了12,000–20,000个主要靠近终止密码子和3′UTRs的峰，通过YTH阅读因子将修饰与RNA稳定性和翻译调控关联。然而，该设计固有地将分辨率限制在约100核苷酸，掩盖了精确位点分配。为克服此限制，通过开发miCLIP等技术，引入UV交联以捕获抗体-RNA加合物作为截断或逆转录突变签名，实现近单核苷酸分辨率。类似地，5-甲基胞嘧啶（m⁵C）通过m⁵C-RIP-seq在转录组上进行定位，揭示广泛但分布不均的候选位点，常出现在胞嘧啶簇中，可能反映转化伪影而非真实甲基化事件。加标和免疫沉淀对照表明，真实m⁵C位点比未甲基化对照显示更强富集，支持更有限和环境依赖的m⁵C景观。针对假尿苷的特异性抗体用于转录组定位，但效果有限，因为基于抗体的伪RIP存在高背景、低重复性和较差的单核苷酸分辨率及化学计量量化，尤其在密集修饰位点。随后，混合方法如光交联辅助Ψ测序（PA-Ψ-seq）通过结合抗体识别与UV交联提高了特异性，实现了细胞和病毒RNA中Ψ的转录组定位，并将特定位点与PUS酶关联。N¹-甲基腺苷（m¹A）RIP最初报道该修饰在mRNA的5′UTR区域广泛存在，但后来使用结构破坏性对照被质疑，其在细胞RNA上的存在仍有争议。m⁷G-MeRIP-Seq用于识别tRNA、mRNA和miRNA上的修饰，显示出高特异性但分辨率有限（约100 bp）。随后，m⁷G-miCLIP-Seq通过结合抗体富集与UV交联，将分辨率提升至约30 bp。尽管取得进展，IP-seq面临显著局限：抗体批次差异导致的重复性差、序列偏好和低分辨率。即使CLIP变体，尽管提高了特异性和分辨率，仍存在UV诱导伪影和无法准确量化低化学计量位点或捕捉癌症等特定背景下的动态变化。因此，对于许多修饰类型，单独的RIP测序方法无法生成高置信度和定量的转录组修饰图谱。特定对照如RNA写入因子的遗传缺失可显著提高特异性和灵敏度。此外，竞争免疫沉淀如m⁶Aseq2允许对修饰进行更定量分析。早期m¹A数据集后来被证明高估了该修饰的普遍性，突出了显著的特异性局限和严格验证的必要性。这种对常规方法的依赖可能阻碍表观转录组学的发展，强调无抗体方法的潜力。

**Chemical and enzymatic probing**
化学探针和RT签名方法是无抗体的互补策略，可潜在地实现超越IP-seq的碱基分辨率精度，克服抗体基础的许多缺点。化学探针技术利用修饰特异性化学反应生成次级标记，最终通过逆转录终止、切割事件或诱变检测。这些技术实现高分辨率和化学计量定量，但依赖苛刻化学条件、环境依赖性酶和RNA二级结构，可能引入降解伪影和假阳性。对于m⁶A，MAZTER-seq利用MazF核酸内切酶无法切割甲基化ACA基序，生成精确映射约7,000个位点的片段模式。DART-seq将m⁶A结合YTH阅读域与ADAR脱氨酶融合，通过A-to-I编辑酶促标记位点，绕过抗体但需要计算偏差校正。对于m⁵C，最小直接聚合酶扰动使得RT签名不可靠，需要亚硫酸氢盐预处理作为关键方法学要求。RNA m⁵C位点受到保护免于亚硫酸氢盐介导的C-to-U转化，亚硫酸氢盐RNA测序通过超快协议鉴定约1,000个高置信度m⁵C mRNA位点，但结构化区域阻碍完全反应。Ψ检测技术利用N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺对甲苯磺酸盐（CMCT）与假尿苷N3位的反应性，形成RT阻断加合物，通过Pseudo-seq映射为RT终止点或突变签名，鉴定真核mRNA中约200–500个动态位点。CeU-seq将CMCT处理与生物素-链霉亲和素沉淀结合，灵敏度提高10倍。HydraPsiSeq采用基于Ψ残基对肼诱导切割的特定保护定量方法，通过与体外转录未修饰对照标准化实现绝对化学计量量化。总体上，这些方法化学上精确但易受非Ψ结构造成的RT伪影影响，这些伪影会夸大低占有率修饰调用。随后开发的基于2-溴丙烯酰胺辅助环化测序（BACS）方法允许准确定量Ψ化学计量、精确定位和稳健检测密集修饰位点。Ψ-seq变体捕捉CMC诱导的截断，但非Ψ结构性终止需要计算筛选。硼氢化还原测序（BoRed-seq）用于识别m⁷G位点及多种RNA亚型，该技术依赖于带电m⁷G残基在低pH下对硼氢化物还原的敏感性，导致咪唑环打开，可用于产生脱碱基位点或特异性富集。BoRed-seq通过结合硼氢化物还原与醛反应探针（ARP）捕获，检测到miRNA内部m⁷G，并揭示了与抑制细胞迁移相关的修饰。TRAC-seq通过大小选择RNA、用脱甲基酶AlkB处理去除主要tRNA修饰、钠硼氢化物（NaBH₄）还原m⁷G生成二氢m⁷G脱碱基位点、苯胺切割，实现tRNA m⁷G的无偏单核苷酸映射。Bo-seq将硼氢化物还原策略扩展至全局基分辨率内部m⁷G定位。m⁷G-MaP-seq通过硼氢化物诱导的脱碱基位点突变在逆转录过程中检测m⁷G位点。对于2′-O-甲基化（Nm），Nm-seq利用甲基化与未甲基化核糖对高碘酸氧化的差异敏感性，实现碱基分辨率定位，但Nm的化学惰性继续限制检测灵敏度。RiboMethSeq基于2′-O-甲基化磷酸二酯键对碱水解的差异保护，通过随机片段化RNA的高通量测序评分甲基化位点的特征性5′-端缺失。m¹A的正电荷可直接干扰逆转录，触发可量化的RT错配，但二级结构混淆使tRNA T环定义可靠。m¹A产生显著的RT签名（>50%停滞，A-to-G/T误读），使m¹A-seq识别约200个细胞质基序，后通过结构破坏性对照精炼为约20–50个真实位点，但电荷和折叠效应重叠使解释复杂化。为克服这些局限，基于还原的m¹A-seq（red-m¹A-seq）利用NaBH₄还原提高突变和通读率，同时碱催化的Dimroth重排将m¹A转化为m⁶A作为内部对照，实现更高灵敏度检测。尽管如此，该技术未能可靠地识别细胞mRNA上的m¹A，其在mRNA亚型上的存在仍有争议。A-to-I编辑产生A-to-G转换，通过与基因组DNA比较确认以排除多态性，但其依赖RNA双链结构限制了可检测位点范围。尽管取得进展，RNA不稳定性、降解伪影和结构伪影导致的约20–30%假阳性率限制了独立的化学探针和RT签名。写入因子敲除实验提供最直接的正交对照：遗传缺失一个表观转录组写入因子会消除其同源修饰，允许自信地区分真实信号和假阳性。

**Mass spectrometry approaches**
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）提供了表观转录组学的金标准化学特异性，将RNA水解为核糖核苷，通过HILIC/反相色谱分离、ESI离子化、MRM转换（如m⁶A: m/z 282→150）定量，实现飞摩尔灵敏度和<5%方差。其他修饰可通过MS²方法在总RNA上定量。这种无与伦比的定量准确性使LC-MS/MS成为RNA修饰绝对化学计量量化的金标准，这是基于测序的方法尚无法复制的关键基准。LC-MS/MS直接测量修饰与未修饰核苷的摩尔比，支持严格的跨样本和跨条件比较，对校准测序调用者的输出和检测写入因子遗传或药理扰动后的化学计量变化特别有价值。然而，这种限制阻止检测环境依赖的RNA修饰动态，这些动态在不同转录本、细胞状态和环境条件下变化。研究表明相同修饰（如m⁶A）可因环境施加不同调控效应，突出需要转录本分辨方法来捕获功能性表观转录组调控。除了全局定量，LC-MS/MS已应用于混合工作流以解析环境依赖的修饰化学计量，如通过精炼质谱方法将m⁷G映射到let-7e-5p miRNA内的单个鸟苷，证明METTL1依赖性m⁷G甲基化是序列环境依赖的，并以位置特异性方式影响miRNA二级结构和加工。这种混合LC-MS/MS-测序工作流有力地锚定化学身份和化学计量到测序衍生的位置信息，弥补MS单独的平均化局限。尽管定量精确，批评者指出其位置盲目性、高样本需求和水解伪影，即使在混合工作流中，方法学不一致可能放大不确定性。这些约束确认其作为确认锚点而非发现驱动器的角色，敦促标准化多模式基准来完善表观转录组学的严谨性。

**Nanopore direct RNA sequencing**
牛津纳米孔长读段测序代表核酸测序的新方法，是首个允许直接测序天然DNA和RNA分子的商业化技术。该技术代表在单分子水平上剖析真核细胞基因组和转录组特征的前进步伐。此外，纳米孔直接RNA测序（dRNA-seq）代表了表观转录组学最大胆的近期进展。早期直接RNA测序尝试因RNA二级结构和转录后化学修饰导致碱基识别效率低。最近，这些扰动从RNA碱基识别器的缺陷转化为特征，以特异性识别多种不同RNA修饰。这些进展通过开发机器学习分类器（xPore、EpiNano、nanoDoc、CHEUI）实现，这些分类器能够以单分子化学计量和多标记共现调用RNA修饰，保留天然背景而无需逆转录或其他化学处理。这些计算工具通过机器学习生成，系统首先被训练区分修饰与未修饰的合成RNA，随后碱基识别器在野生型与敲除细胞的RNA上训练。模型被证明能够从原始直接RNA纳米孔测序信号中分配单碱基分辨率修饰概率；然而，尽管召回率高达约0.92且化学计量相关性强，每个位点的假发现率仍然显著升高，对于m⁶A在Dorado中达到约40%，假尿苷约95%，主要由这些修饰的低转录组普遍性而非测序错误驱动。一个关键挑战是从单次测序运行中同时识别多种修饰类型。TandemMod通过实施迁移学习框架解决此问题，利用高质量m⁶A训练数据引导m⁵C、m⁷G、Ψ和肌苷的分类器，需极少额外合成数据。m⁶Aiso方法通过耦合内源DART-seq标记（APOBEC1-YTH融合引入C-to-U突变近m⁶A位点）与纳米孔DRS读段，实现异构体特异性m⁶A定量，揭示同一基因组m⁶A位点在不同mRNA异构体上可携带不同的修饰化学计量。信号比对准确性（所有基于电流的修饰调用器的限制因素）通过Uncalled4显著改善，该工具提供原始纳米孔信号到参考序列的快速精确映射，减少由信号漂移引起的假阳性调用。在多标记分类层面，ModiDeC证明m⁶A、肌苷、Ψ、2′-O-甲基鸟苷和m¹A可在单次DRS运行中同时区分，使用在合成拼接连接RNA构建体上训练的深度学习分类器，并在人类细胞系和血液样本中验证。最近，DirectRM将位点水平检测与共现分析整合，从单次天然RNA数据集中实现多种修饰类型间相互作用的转录组图谱绘制，绕过IVT衍生伪影。每种修饰呈现其自身检测景观，反映表观转录组的化学多样性。m⁶A最可靠地干扰转位，xPore通过METTL3敲除基准测试达到约90%精确率/召回率，估计30–70%占有率；然而，化学依赖性信号漂移跨流动池限制了批次间和平台间的可重复性。m⁵C提出不同挑战，其离子信号与未修饰胞嘧啶噪声广泛重叠；CHEUI的联合建模部分克服此问题，检测约1,000个共修饰转录本，但孤立位点仍难以自信调用。假尿苷（ψ）通过碱基识别矛盾信号和原始离子电流信号的检测受强序列背景依赖性影响，使得推断修饰占有率缺乏定量准确性，位点水平置信度仍多变。m¹A引入进一步复杂化，其正电荷扰动在光谱上与m⁶A相似，需要异常检测方法如IL-AD进行从头识别，但实践中仍易出错。最后，肌苷由ADAR介导的A-to-I编辑生成，传统上从Illumina RNA-seq数据中的A-to-G错配推断，但该方法在短外显子、注释不良基因组或突变富集疾病背景下不可靠；纳米孔直接RNA测序提供有前景的替代方案，用卷积神经网络区分肌苷与腺苷和鸟苷，并以改进准确性估计单个位点的编辑水平。通过纳米孔直接RNA测序耦合机器学习，开发了NanoNm作为预测模型，在含Nm修饰的rRNA数据集上训练。应用NanoNm揭示前列腺癌细胞中癌症相关mRNA上Nm位点富集。尽管纳米孔直接RNA测序实现无抗体、单分子分析及共发生修饰检测，但其受微妙的背景依赖性信号位移和影响灵敏度与可重复性的计算模型限制。多数应用中的主要限制是纳米孔测序的高错误率，R9.4孔为6–15%，显著高于Illumina短读段平台的0.1–1%。此外，修饰如m⁷G因信号签名弱而难以解析，强调需要正交验证以确保稳健的表观转录组映射。混合方法如结合化学处理与纳米孔直接RNA测序可能有助于识别纳米孔碱基识别器无法直接识别的一化学计量修饰。

**Computational approaches**
与测序技术一起，转录组上RNA修饰的识别需要开发既灵敏又特异的关键计算工具。转录组修饰数据的解释与从实验中提取信号的计算框架密不可分，两者在复杂性上共同进化。基于现有表观转录组数据集，并为了克服实验局限，开发了RNA修饰预测器，能够识别潜在修饰位点。早期基于序列的工具表明，仅凭RNA序列背景即可合理准确预测m⁶A位点：SRAMP是首批预测器之一，使用在DRACH基序特征上训练的随机森林分类器，独立于实验富集对候选位点进行优先级排序。随后的深度学习架构显著提高了精度和异构体水平分辨率，如deepSRAMP结合Transformer和循环网络模块预测不同哺乳动物细胞类型中单个转录异构体的m⁶A。类似机器学习策略已扩展到m⁶A以外的修饰，利用纳米孔直接RNA测序记录的独特离子电流签名。例如，Penguin证明在原始ONT信号特征和碱基识别k-mer表示上训练的SVM、随机森林和神经网络分类器集成可以超过93%的准确性识别Ψ位点，显著优于当代仅序列Ψ预测器，建立了纳米孔信号级特征提取作为修饰特异性位点检测的可行途径。

**Epitranscriptomic repositories**
跨方法、物种和疾病背景的转录组修饰数据积累推动开发了专门公共数据库，以标准化、注释和交叉参考这些多样化数据集。DirectRMDB是首个专门来源于纳米孔直接RNA测序的RNA修饰位点仓库，从39项独立研究中编录了25个物种中904,712个位点的16种修饰类型，并提供短读段数据库无法提供的异构体感知修饰轮廓视图。针对m⁶A修饰，m⁶A-Atlas v2.0整合了跨多个物种的797,091个高置信度碱基分辨率m⁶A位点，集成单细胞轮廓并提供写入-擦除-阅读因子靶标关联工具。扩展到修饰位点目录之外，RMBase v3.0整合超过1,880个高通量数据集以注释62个物种中的73种不同修饰类型，具有将修饰位点与RNA结合蛋白互作组、miRNA靶标重叠、GWAS疾病变体和组蛋白修饰共现模式关联的模块。补充位点水平资源，RMDisease v2.0专门解决遗传变异与表观转录组调控之间的关系，编录落于或邻近实验定位修饰位点的单核苷酸变体，并将其与GWAS相关性状和疾病表型关联。对于组织分解分析，m⁶A-TSHub提供来自23种人类组织类型的背景特异性m⁶A轮廓，以及经过筛选的m⁶A影响单核苷酸突变集合。这些数据库共同构成该领域的分层基础设施：从原始修饰位点目录和化学计量测量，到写入-擦除-阅读因子靶标网络，再到疾病变体关联和组织分解景观，它们将个体高通量实验的碎片化输出转化为集成的可查询知识库，对将描述性修饰图谱转化为机制和临床见解至关重要。

**Discussion**
这篇以技术为中心的综述突出了当前检测最重要转录后RNA修饰（即m⁶A、m⁵C、Ψ、m¹A、m⁷G、Nm和A-to-I编辑）的表观转录组方法。总体而言，所描述的每种方法对识别特定修饰在转录组内的分布都极为有价值。正是得益于这些技术，表观转录组领域在过去二十年取得了巨大进展。尽管如此，每种技术都有特定局限，只有通过整合正交方法才能在转录组范围内识别高置信度修饰。IP-seq快速定位热点，但受限于粗分辨率（约100 nt）和因抗体偏差和交叉反应导致的重复性差（<50%）。化学和酶学探针实现碱基分辨率精度，但需要大量RNA输入并可能引起降解。RT基签名提供更简单、经济高效的读出，但假阳性率达20–30%。纳米孔测序保留天然RNA背景并检测共发生标记，但仍受限于模型依赖误差和5–20% FDR。RNA质谱尽管对RNA修饰检测极其灵敏，但在其RNA序列背景下表征表观转录组标记方面用途有限。遗传扰动（包括敲除、敲低和过表达系统）代表表观转录组学中最直接的因果推断框架，通过比较扰动和野生型状态以区分真实修饰位点与技术伪影，同时阐明功能角色。CRISPR-CAS9是生成此类模型的极具价值和灵活的技术，采用高保真Cas9变体（如HiFi Cas9）结合克隆验证策略可最小化脱靶效应。特定表观转录组调控因子的功能解析突显了遗传缺失策略在清除背景噪声和验证修饰特异性信号方面的力量。METTL3/14敲除消除约90%的MeRIP-seq峰，建立高置信度m⁶A基线并揭示癌基因转录本的稳定化。类似地，NSUN2和DNMT2的缺失干净地移除tRNA和mRNA上大部分m⁵C标记，隔离修饰依赖的对转录本稳定性和应激反应的影响。PUS1、PUS7和TRUB1敲除提供明确的假尿苷缺失背景，以发现与翻译控制相关的动态调控Ψ位点，而TRMT6/61A/B缺失阐明m¹A依赖的tRF-3途径基因沉默。ADAR1/2双敲除导致A-to-I编辑近乎完全丧失，建立肌苷检测的明确未编辑基线。这些遗传模型仍然是基准测试计算修饰调用器和区分真实表观转录组信号与技术噪声不可或缺的参考框架。克服表观转录组技术局限的第二种策略是它们之间的正交整合。两种独立方法如抗体免疫沉淀和直接RNA测序可整合以从背景噪声中识别真实修饰。例如，m⁷G BoRed-seq和m⁷G RIP结合鉴定肺癌细胞中修饰的miRNA；类似地，基于纳米孔直接RNA测序的m⁶A调用与来自同一细胞系的miCLIP-seq轮廓相交，重叠位点代表由两种独立检测原理支持的高置信度真实m⁶A修饰。另一种方式是结合两种方法以提高灵敏度、分辨率和特异性。MiCLIP是这种混合方法的明确例子，m⁶A抗体用于识别修饰碱基，UV交联用于生成可通过RT终止和诱变检测的特异性RNA-抗体加合物。混合工作流有效弥合这些差距：纳米孔测序提名候选位点，然后通过亚硫酸氢盐测序或LC-MS/MS验证以确认化学身份和化学计量。整合性管道结合IP峰、RT签名和MS数据以解析共修饰，而通过定位方法识别的候选位点可指导靶向CRISPR验证。关键挑战包括检测稀有或低化学计量修饰、解析环境依赖伪影、实现可重复定量以及将修饰与功能结果关联。整合正交方法、纳米孔测序、化学探针、IP定位、RT签名和遗传扰动的混合方法对于稳健的表观转录组定位至关重要。向前看，标准化基准、严格验证和计算创新对于将描述性图谱转化为机制见解和治疗机会至关重要。

**Emerging trends and future perspectives**
三个新兴前沿正有望重塑该领域。首先，单细胞表观转录组学正从概念验证过渡到常规应用：MeRIP-seq的极低输入量适应和纳米孔直接RNA测序与单细胞条形码策略的集成开始揭示通过批量方法无法识别的细胞类型特异性修饰景观。这些进展对于剖析癌症细胞可塑性、干细胞命运决定和治疗耐药性下的表观转录组异质性必不可少。其次，当前多数方法需要RNA提取，这折叠了可能存在于特定亚细胞区室、多核糖体组分或应激颗粒中的动态修饰状态。基于活细胞兼容逻辑（如亚硫酸氢盐转化或CMCT标记）的细胞渗透性化学探针的开发是下一代表观转录组工具的首要目标。第三，尽管空间转录组学彻底改变了我们对癌症及其微环境的理解，除了A-to-I转换外，表观转录组检测技术仍无法空间分辨修饰。理论上，一种可能的方法是为m⁶A检测开发空间DART-seq方法，其中RNA在原位由YTHDF1-APOBEC1融合编辑，随后进行空间转录组分析。表观转录组的治疗开发正从观察到干预迅速推进，精确且化学计量准确的检测方法对于表观转录组治疗剂的开发至关重要。靶向METTL3、FTO和ALKBH5的药理抑制剂正通过临床前管线推进，其中一些在AML、胶质母细胞瘤和实体瘤模型中显示出疗效。除了小分子策略，使用CRISPR-Cas13-写入因子或-擦除因子融合的表观转录组编辑提供了可编程、位点特异性调节个体修饰位点的能力，开辟了因果机制剖析和潜在治疗重编程异常表观转录组电路的途径。这些方向共同强调检测方法和生物学应用是共同进化的：一个领域的进步直接推动另一个领域的发展。