激活素A(Activin A)通过PGC-1α/NRF1/TFAM轴减轻脑缺血再灌注损伤中的铁死亡(Ferroptosis)

《Frontiers in Neurology》：Activin A mitigates ferroptosis in cerebral ischemia/reperfusion injury via the PGC-1α/NRF1/TFAM axis

　　

背景：脑缺血/再灌注(I/R)损伤严重限制缺血性卒中再通治疗的疗效。激活素A(Activin A, Act A)作为一种神经营养性细胞因子具有保护潜力，但其与线粒体生物发生及铁死亡调节相关的机制尚不清楚。方法：体内实验采用成年雄性Wistar大鼠(12只/组)行2 h大脑中动脉闭塞(MCAO)及24 h再灌注，术前侧脑室注射Act A(7.5 μg/kg)或 Vehicle；通过TTC染色、透射电镜(TEM)及免疫组化(IHC)分析脑梗死体积、组织损伤及PGC-1α表达。体外实验采用HT22细胞经氧糖剥夺/复氧(OGD/R, 8 h/24 h)处理并以Act A(100 ng/mL)干预，通过qPCR、Western blot、流式细胞术、激光共聚焦及染色质免疫沉淀(ChIP)检测铁死亡标志物、线粒体功能及相关信号通路。结果：体内实验中，Act A显著缩小梗死体积(p < 0.001)、降低丙二醛(MDA)水平(p < 0.001)、上调PGC-1α表达(p < 0.001)及mtDNA拷贝数(p < 0.05)。体外实验中，Act A挽救OGD/R诱导的铁死亡，抑制脂质活性氧(ROS)(p < 0.01)及Fe2+蓄积(p < 0.05)，激活PGC-1α/NRF1/TFAM轴(p < 0.05)并促进线粒体生物发生；机制上Act A通过Smad3结合PGC-1α启动子促进其转录(p < 0.05)，并通过p38-MAPK磷酸化增强PGC-1α活性(**p < 0.001)；沉默PGC-1α可消除Act A的神经保护作用。结论：Act A通过Smad3和p38-MAPK双途径激活PGC-1α，增强线粒体生物发生并抑制神经元铁死亡，从而减轻脑I/R损伤，提示Act A是缺血性卒中的潜在治疗候选分子。

本研究发表于《Frontiers in Neurology》。

论文解读

缺血性卒中是全球重大公共卫生问题，早期血管再通是治疗急性期最有效措施，但再灌注本身可诱发脑缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤，导致继发性神经功能恶化和脑水肿，其发病机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍、钙超载及炎症级联反应。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，以脂质活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）爆发性累积和脂质过氧化为特征，是脑I/R损伤中神经元死亡的主要方式之一。线粒体作为细胞内ROS的主要来源及铁死亡调控的关键细胞器，其稳态维持——包括线粒体生物发生（Mitochondrial Biogenesis）、分裂融合动力学及线粒体自噬——对抗铁死亡至关重要。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1-alpha, PGC-1α）是线粒体生物发生的主调控因子，可招募核呼吸因子1（Nuclear Respiratory Factor 1, NRF1），进而激活线粒体转录因子A（Mitochondrial Transcription Factor A, TFAM）以促进mtDNA复制与转录。已有研究表明PGC-1α激活可增强线粒体生物发生并抑制神经元铁死亡。激活素A（Activin A, Act A）属转化生长因子β（Transforming Growth Factor-beta, TGF-β）超家族，可通过经典Smad通路及非经典p38-丝氨酸/苏氨酸激酶（p38-Mitogen-Activated Protein Kinase, p38-MAPK）通路发挥生物学效应，且既往提示Act A/Smad轴可调控线粒体质量控制系统，但Act A是否及如何通过PGC-1α/NRF1/TFAM轴调控线粒体生物发生并抑制脑I/R中铁死亡尚不明晰。为此，研究人员通过建立大鼠MCAO/R模型及HT22细胞OGD/R模型，探讨Act A对脑I/R损伤的神经保护机制及其与PGC-1α介导的线粒体生物发生和铁死亡的关系。

主要关键技术方法

研究人员采用体内、体外两部分实验：①体内实验——健康成年雄性Wistar大鼠建立2 h大脑中动脉闭塞/24 h再灌注（MCAO/R）模型，术前1 h侧脑室微量注射Act A(7.5 μg/kg)或Vehicle，设假手术对照组，每组12只；通过TTC染色测梗死体积、HE及透射电镜（TEM）观察病理及线粒体超微结构、免疫组化及qPCR检测PGC-1α表达及mtDNA(ND1/β-actin)拷贝数、硫代巴比妥酸法测皮质MDA含量、Bederson评分评估神经功能。②体外实验——小鼠海马神经元HT22细胞建立8 h氧糖剥夺/24 h复氧（OGD/R）模型，给予Act A(100 ng/mL)干预；采用CCK-8测活力；C11-BODIPY探针流式细胞术及激光共聚焦测脂质ROS；Ferro Orange探针共聚焦测Fe²⁺；Western blot检测铁死亡标志蛋白ACSL4、GPX4及PGC-1α/NRF1/TFAM、p-Smad2/3、p-p38-MAPK等；qPCR检测PGC-1α/NRF1/TFAM mRNA及mtDNA相对拷贝数；MitoTracker Green FM流式测线粒体质量；JC-1探针测线粒体膜电位（ΔΨm）；ATP发光法测细胞ATP；MitoSOX Red测线粒体内ROS；染色质免疫沉淀结合qPCR（ChIP-qPCR）验证p-Smad3与PGC-1α启动子结合；siRNA转染沉默PGC-1α后进行挽救实验验证依赖性。

研究结果

3.1 Act A ameliorated cerebral I/R injury and promoted PGC-1α expression in rats undergoing MCAO/R

研究人员将大鼠分为Sham、MCAO/R+Vehicle、MCAO/R+Act A三组。TTC染色显示Act A组梗死体积百分比显著低于Vehicle组(p < 0.001)；HE染色示Act A组神经元排列较规整、核结构较完整、间质水肿减轻；TEM显示Vehicle组神经元线粒体呈铁死亡特征性改变（体积缩小、膜密度增高、红箭头示），Act A组此类线粒体减少；皮质MDA含量Act A组较Vehicle组显著降低(p < 0.001)；免疫组化显示Act A组皮质PGC-1α蛋白表达显著高于Vehicle组(**p < 0.001)；qPCR示Act A组mtDNA(ND1/β-actin)拷贝数较Vehicle组升高(p < 0.05)。结论：Act A减轻大鼠MCAO/R后组织损伤及神经元铁死亡倾向，并促进PGC-1α表达及线粒体生物发生。

3.2 Activin A mitigated neuronal ferroptosis in an in vitro model of cerebral I/R injury

研究人员将HT22细胞分为Control、OGD/R、OGD/R+Act A三组。CCK-8显示Act A提高OGD/R后细胞存活率(p < 0.01)；流式细胞术及激光共聚焦显示OGD/R组脂质ROS显著升高，Act A处理后显著降低(p < 0.01)；MDA定量OGD/R+Act A组低于OGD/R组(p < 0.01)；激光共聚焦Ferro Orange示OGD/R组胞内Fe²⁺升高，Act A逆转此现象(p < 0.05)；Western blot示OGD/R组ACSL4上调、GPX4下调，Act A处理使GPX4回升、ACSL4回降(p < 0.05)。结论：Act A通过抑制脂质ROS和Fe²⁺蓄积、上调GPX4及下调ACSL4减轻OGD/R诱导的神经元铁死亡。

3.3 Activin A promoted mitochondrial biogenesis in OGD/R cells by activating the PGC-1α/NRF1/TFAM pathway

qRT-PCR及Western blot显示OGD/R抑制PGC-1α、NRF1、TFAM的mRNA及蛋白表达，Act A显著上调三者表达(p < 0.05或p < 0.01)；mtDNA拷贝数Act A组高于OGD/R组(p < 0.01)；MitoTracker Green FM流式示OGD/R组线粒体荧光强度降低，Act A恢复(p < 0.05)；ATP发光法示Act A回升OGD/R降低的ATP(p < 0.05)；JC-1示Act A恢复红/绿荧光比即稳定ΔΨm(p < 0.05)；MitoSOX Red示Act A降低OGD/R升高的线粒体内ROS(**p < 0.01)。结论：Act A通过激活PGC-1α/NRF1/TFAM轴恢复线粒体生物发生、改善能量代谢及膜电位并减轻线粒体ROS。

3.4 Activin A activated PGC-1α through canonical and non-canonical pathways

Western blot示Act A处理后OGD/R细胞中p-Smad2/3升高(p < 0.01)，p-p38-MAPK升高(p < 0.001)；ChIP-qPCR用三种引物扩增PGC-1α启动子区，p-Smad3抗体免疫沉淀组中PGC-1α启动子片段富集度显著高于IgG对照(p < 0.05)。结论：Act A经经典Smad通路使Smad3磷酸化并直接结合PGC-1α启动子促其转录，同时经非经典p38-MAPK通路磷酸化激活PGC-1α，双途径协同上调PGC-1α。

3.5 PGC-1α silencing abrogated act A-mediated neuroprotection in cerebral I/R injury

siRNA敲低PGC-1α效率达约70%(p < 0.05)。在si-NC+OGD/R+Act A组Act A可上调存活率、PGC-1α/NRF1/TFAM表达及线粒体质量，而si-PGC-1α+OGD/R+Act A组中此保护效应消失——细胞存活率未恢复(p < 0.05)、PGC-1α/NRF1/TFAM mRNA及蛋白未上调、MitoTracker示线粒体质量未增加。结论：Act A对线粒体生物发生的促进作用完全依赖于PGC-1α的存在。

3.6 Silencing PGC-1α abolished act A-mediated amelioration of mitochondrial dysfunction and neuronal ferroptosis

在si-PGC-1α+OGD/R+Act A组，ATP水平较si-NC+OGD/R+Act A组降低(p < 0.001)、JC-1红/绿比未恢复(p < 0.05)、MDA含量未降低(p < 0.001)、脂质ROS及Fe²⁺荧光强度未被Act A抑制(p < 0.05)。结论：沉默PGC-1α消除Act A对线粒体功能改善及抗铁死亡的作用，证实Act A神经保护严格依赖PGC-1α信号。

讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，脑I/R损伤涉及多种细胞死亡方式，其中铁死亡由脂质过氧化物驱动，线粒体是ROS主要来源且与铁死亡调控密切相关；PGC-1α作为线粒体生物发生主调控因子可通过改善线粒体抗氧化能力、影响多不饱和脂肪酸合成及招募NRF2至GPX4启动子抑制脂质过氧化来拮抗铁死亡；本研究发现脑I/R后PGC-1α表达下降伴mtDNA拷贝数减少及线粒体生物发生受损，而Act A可上调PGC-1α并通过Smad3直接结合其启动子促转录，同时通过p38-MAPK磷酸化增强PGC-1α活性，双重激活PGC-1α/NRF1/TFAM轴，恢复mtDNA合成、增加线粒体质量、稳定膜电位及ATP产生，最终抑制脂质ROS和Fe²⁺蓄积、下调ACSL4、上调GPX4，减轻神经元铁死亡及脑梗死体积；siRNA敲低实验证实该保护效应依赖PGC-1α。此外Act A在中枢神经系统具多重调控功能，本研究拓展了其神经保护机制。未来需明确外源性Act A最佳给药途径及药代动力学，并克服大分子蛋白透过血脑屏障的难题，或开发小分子模拟物推进临床转化。

结论（翻译）

激活素A(Activin A)通过Smad3和p38-MAPK双通路协同激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)，增强线粒体生物发生并抑制神经元铁死亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤。这确立了Activin A作为缺血性卒中治疗候选分子的潜力。