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摘要：豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）是一种强感光周期性的昆虫。尽管生物钟（circadian clock）参与昆虫光周期反应（photoperiodism）已被充分证实，但时钟神经元传递光周期信息的神经元及分子机制仍很大程度上未知。神经肽常作
摘要：豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）是一种强感光周期性的昆虫。尽管生物钟（circadian clock）参与昆虫光周期反应（photoperiodism）已被充分证实，但时钟神经元传递光周期信息的神经元及分子机制仍很大程度上未知。神经肽常作为生物钟神经元中的神经信使发挥作用，然而关于豌豆蚜生物钟的神经肽组织构成知之甚少。本研究通过转录组学和肽组学（peptidomic）方法表征了蚜虫脑中完整的神经肽集合，并利用免疫组织化学（immunohistochemistry）检测了生物钟神经元中表达的神经肽。研究人员确认了大量肽段，包括若干首次在该物种中描述的肽。此外，研究发现生物钟神经元表达多种此类神经肽，其中部分在同一类时钟神经元内共定位。侧部时钟神经元（lateral clock neurons）中检测到色素分散因子（Pigment-Dispersing Factor, PDF）、FMRFamide（FMRFa）、Orcokinina（OKa）和促变胸腺素（Allatotropin, AT），该神经肽谱与蜚蠊目时钟神经元高度相似，但与果蝇（Drosophila）差异显著（PDF除外）。背部时钟神经元（dorsal clock neurons）——同源干果蝇中介导胰岛素产生细胞（Insulin-Producing Cells, IPCs）输入的那群——中检测到抑咽侧体素A（Allatostatin A, AstA）、利尿激素31（Diuretic Hormone 31, DH31）、FMRFamide及肌抑制肽（Myoinhibitory Peptide, MIP）。综上，本研究首次提供了豌豆蚜生物钟相关神经肽的综合图谱，为理解时钟神经元如何调控季节响应提供了新见解，并为后续神经肽介导的光周期功能研究奠定基础。
论文解读：豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）生物钟相关神经肽（Clock-related Neuropeptides）的研究
《Frontiers in Genetics》刊载的此研究针对重要农业害虫豌豆蚜的光周期依赖性生活史转换（有性/无性生殖切换）机制，聚焦中枢生物钟神经元所分泌之神经肽信号系统。目前昆虫生物钟参与光周期响应的分子与神经解剖通路在半翅目昆虫中尚不明晰，且豌豆蚜脑内时钟神经元之神经肽表达谱完全未被绘制。已有模式生物果蝇（Drosophila melanogaster）和蜚蠊（cockroach）表明时钟神经元富含多种神经肽（如PDF、AstA、MIP、OKa等）作为网络内通讯与下游输出信号，但蚜虫是否保守或特化尚无报道。明确蚜虫时钟神经肽组成是揭示其季节适应生理及开发肽类仿生农药之基础。研究人员整合转录组挖掘、高分辨质谱肽组学鉴定及多标记免疫荧光共定位技术，系统解析了豌豆蚜脑及视叶组织中的神经肽前体库、成熟加工肽段及其在各类时钟神经元（背侧DNs、外侧LNs及视网膜Lamina神经元LaNs）内的表达与共存模式，并与已知昆虫模型进行演化比较。
主要关键技术方法：
研究人员采用LSR1品系豌豆蚜，在16L:8D光周期下饲养。取头部分离脑（central brain, CB）与视叶（optic lobes, OL）分别处理。主要方法含：（1）基于公共RNA-Seq数据使用Trinity进行de novo组装，tBLASTn检索已知昆虫及已报道蚜虫神经肽前体序列，补充新前体；（2）MALDI-TOF直接组织质谱及Q-Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS串联质谱分析脑与视叶提取肽段，通过MS2碎片确认成熟肽身份；（3）多色免疫荧光组织化学双重标记，使用抗Period（PER）、Cryptochrome1（CRY1）、PDF及数种跨物种验证之抗神经肽一抗（抗AstA、DH31、MIP、OKa、FMRFa、AT、CCHamide1等），辅以预吸附及对照验证特异性，激光共聚焦成像观察共定位。
研究结果
3.1 Detailed description of the pea aphid neuropeptide inventory
通过转录组搜库补充了豌豆蚜神经肽前体列表，新增HanSolin、Carausius Neuropeptide-like Precursor（CNP1）、PeaNPLP1、RYamide（RYa）、IDL-containing peptide、natalisin、NVP-like及更新CCHa1/CCHa2与Pyrokinin（PK）等前体。未检出Corazonin、Sulfakinin、ACP、Calcitonin A/B、CNMamide、Elevenin、IMFamide、Orcokininb（OKb）、Tryptopyrokinin、RFLamide及Pyrokinin-like前体，提示这些基因可能在蚜虫基因组缺失。胰岛素样肽（Insulin-like Peptides, ILPs）仅获ILP1、ILP4-6、ILP11转录本。
3.2 Confirmation of expressed mature neuropeptides in the aphid brain via mass spectrometry
Orbitrap与MALDI-TOF MS从脑和视叶中共预测92条潜在活性肽与21条前体相关肽（precursor peptides, PPs），其中68条经MS2碎片确证，包括来自AstA、MIP、FMRFa、sNPF、OKa、PK等前体的成熟肽。脑较视叶肽多样性更高，视叶仅见sNPF、TKRP、AstA、SIFa、OKa、NVP-like产物。AT在视叶被确认酰胺化片段，支持其在时钟相关区域存在。
3.3 Confirmation of expressed neuropeptides in the clock neurons of aphids by immunohistochemistry
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3.3.1 The lamina clock neurons contain AT and CCHa1
所有Lamina时钟神经元（LaNs）共表达Allatotropin（AT）与CCHamide1（CCHa1），与PER共定位，表明LaNs具特定神经肽标志。
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3.3.2 Subsets of PDF-positive lateral neurons contain additionally AT, OKa, and FMRFa
4个PDF阳性外侧时钟神经元（LNs）全部含FMRFa，其中3个共表达AT与OKa，至少2个LN同时含PDF+FMRFa+AT+OKa。此组合贴近蜚蠊AME（accessory medulla）神经元特征而非果蝇。
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3.3.3 The dorsal neurons contain FMRFa, MIP, AstA, and DH31, with AstA and DH31 restricted to CRY-negative neurons
背侧时钟神经元（DNs）分两亚群：2个CRY阳性DN共含FMRFa与MIP；5–6个CRY阴性DN共含AstA与DH31（二者互相同一定位），AstA/DH31阳性DN不与FMRFa/MIP重叠。
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3.3.4 AstA-positive dorsal neurons project toward the insulin-producing cells
AstA阳性DN之轴突投射至pars intercerebralis（PI）区，与表达ILP4之胰岛素产生细胞（IPCs）树突紧密毗邻，暗示AstA信号可调控IPC活动，类比果蝇中AstA→IPC通路。
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3.3.5 CCHa1 is absent from the aphid dorsal clock neurons
CCHa1免疫反应见于背脑1–2个非时钟神经元，不与PER阳性DN/DLN/LN共标，故CCHa1不属蚜虫时钟神经元组份（区别于果蝇部分DN）。
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3.3.6 SIFa immunoreactivity is conserved in aphids, and it labels four neurons in the pars intercerebralis that are distinct from those that are ILP4-positive
SIFamide（SIFa）标记PI区4个保守中间神经元，轴突入腹神经索，不与ILP4阳性IPC重叠，分布模式与其他昆虫高度保守。
讨论与结论总结（翻译浓缩）：
研究人员构建了迄今最完整的豌豆蚜神经肽前体与成熟肽清单，发现10类昆虫常见神经肽基因在蚜虫缺失。时钟神经元神经肽图谱显示：外侧时钟神经元（LN）含PDF＋FMRFa＋OKa＋AT，近似蜚蠊而不同于果蝇（缺ITP、NPF、AstC）；背侧时钟神经元（DN）分CRY+/FMRFa+/MIP+与CRY?/AstA+/DH31+亚群，后者投射近ILP4+IPCs。Lamina神经元含AT与CCHa1。整体而言蚜虫时钟神经肽架构介于蜚蠊与果蝇间，偏向蜚蠊型LN而DN部分似果蝇。鉴于DN/LN→IPC连接及PDF/AstA受体可能介导光周期信号至内分泌系统，该图谱为蚜虫光周期响应之神经肽机制提供解剖学基础，亦支撑以神经肽模拟物干扰蚜虫季节性生殖之害虫防控策略研发。
