《Animal Microbiome》：Optimization of solid-state fermentation process of diets and its effects on growth performance and intestinal function in growing pigs
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摘要背景
生物发酵可通过优化饲料营养特性改善动物生长性能和肉品质。然而，复杂的发酵参数仍需进一步系统优化。本研究旨在建立并优化日粮固态发酵（SSF）工艺，评估发酵后饲料微生物群落与风味代谢物的变化，并探究其对生长猪肌肉发育和肠道屏障功能的影响。研究人员采用4
摘要背景
生物发酵可通过优化饲料营养特性改善动物生长性能和肉品质。然而，复杂的发酵参数仍需进一步系统优化。本研究旨在建立并优化日粮固态发酵（SSF）工艺，评估发酵后饲料微生物群落与风味代谢物的变化，并探究其对生长猪肌肉发育和肠道屏障功能的影响。研究人员采用4种益生菌与11种酶制剂组合，构建了猪饲料协同固态发酵策略，并利用16S rDNA测序（16S rDNA-seq）和风味组学测序（flavoromics-seq）考察发酵后微生物群落及风味化合物的动态变化。随后，将32头Duroc × Jinfen White猪饲喂含10%固态发酵饲料的日粮，以评估其生长性能、肠道健康和肌肉发育。
结果
枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉的最优发酵配比为1:2:3:3，发酵温度为36 °C，接种率为93%，含水量为72%，发酵时间为4.1 d。固态发酵显著提高了饲料营养价值，表现为灰分、有机质（OM）、粗蛋白（CP）和醚提取物（EE）含量升高，同时抗营养因子浓度降低。测序共鉴定出17种差异微生物和116种风味化合物，其中乳杆菌属（Lactobacillus）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度显著升高，2-辛烯醛和香兰素赋予饲料甜香、果香和青草香特征。与此同时，RNA测序（RNA-seq）显示，补充发酵饲料后肌肉组织中存在320个差异表达基因（DEGs），主要富集于细胞色素P450（Cytochrome P450）药物代谢和精氨酸生物合成相关通路。此外，苏木精-伊红染色（H&E staining）结果表明，发酵显著提高了生长猪小肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛/隐窝比值，且空肠中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1水平显著高于对照（ctrl）组。进一步相关性分析表明，厚壁菌门（Firmicutes）可能通过影响其代谢产物而调控猪生长性能及白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。
结论
本研究建立并优化了一种固态发酵（SSF）工艺，该工艺可显著提升饲料营养价值、富集有益微生物并促进独特风味代谢物的形成。将其用于生长猪饲喂时，可有效提高生长性能和抗氧化能力，同时改善小肠形态结构和屏障功能。
该论文发表于《Animal Microbiome》，围绕猪用日粮固态发酵（SSF，solid-state fermentation）工艺优化及其生物学效应展开系统研究。研究背景在于，玉米和豆粕是生长猪日粮的核心营养来源，但其中存在大豆抗原蛋白、胰蛋白酶抑制因子（TI，trypsin inhibitor）和非淀粉多糖（NSP，non-starch polysaccharides）等抗营养因子，会限制营养释放与吸收，并增加肠道不良反应风险。既往研究虽已证实发酵可改善饲料品质和动物生产性能，但液态发酵研究相对较多，固态发酵在现代饲料工业中的参数优化、微生物动态变化、风味代谢物形成及其与动物生长和肠道功能之间的关系，仍缺乏系统整合研究。因此，开展本研究的必要性在于：建立稳定、可优化的菌酶协同固态发酵体系，明确其对饲料营养品质、微生物生态与风味特征的影响，并进一步验证其在生长猪生产中的应用价值。
研究人员以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和黑曲霉（Aspergillus niger）为复合发酵菌株，结合11种酶制剂构建菌酶协同发酵体系，通过正交试验、单因素试验和响应面法（RSM，response surface methodology）筛选最佳发酵配比和工艺条件，并结合16S rDNA测序、风味组学测序、肌肉转录组测序（RNA-seq）及动物饲喂试验，系统评估发酵饲料对饲料品质、生长性能、肉品质、免疫抗氧化状态、小肠形态和肠道屏障功能的影响。研究表明，优化后的SSF工艺可显著提升饲料营养价值、降低抗营养因子和毒素水平、重塑饲料微生物群落与风味谱，并在生长猪中改善生长性能、肌肉发育、抗氧化能力及肠道屏障完整性，显示出较高的饲料开发与养猪生产应用意义。
就主要技术方法而言，研究首先采用正交设计、单因素试验与响应面法优化4菌复合发酵比例和工艺参数；其次利用16S rDNA-seq分析基础饲料与SSF饲料微生物群落结构，利用GC × GC-TOFMS结合风味组学分析挥发性风味代谢物；随后在Duroc × Jinfen White生长猪队列中开展28 d饲喂试验，以10% SSF日粮替代部分基础日粮，并通过血清生化、酶联免疫吸附测定（ELISA）、H&E染色、紧密连接蛋白检测及背最长肌RNA-seq评估动物生长、免疫抗氧化、肠道形态和肌肉转录响应。
在结果部分，论文首先报告“The effect of strain ratios on solid-state fermentation”。研究人员通过正交试验筛选4株菌的最佳复配比例，比较了不同组合对三氯乙酸可溶蛋白（TCA-SP，trichloroacetic acid-soluble protein）、粗纤维（CF）和主要抗营养因子降解效果的影响。结果表明，A1B2C3D3组合在提升TCA-SP和降低豆球蛋白、TI、β-伴大豆球蛋白方面表现最佳，因此被确定为后续优化的最优菌株比例，对应菌种配比为枯草芽孢杆菌:植物乳杆菌:酿酒酵母:黑曲霉 = 1:2:3:3。
在“The effects of different fermentation conditions on solid-state fermented feed”部分，研究人员进一步通过单因素和响应面优化分析含水量、接种量、发酵时间与温度对SSF效果的影响。结果显示，80%含水量时TCA-SP最高且CF最低；接种量9%、发酵时间4 d、温度36 °C时发酵指标较优。响应面模型具有较高拟合度，最终预测的最优条件为接种量9.283%、含水量71.539%、发酵时间4.112 d，验证了该工艺参数组合可实现较优的发酵效果。
在“The impact of solid-state fermented feed with strain-enzyme on feed”部分，研究人员为解决混菌发酵过程中酶产量不足的问题，引入11种酶制剂实施菌酶协同发酵。结果显示，协同发酵较单纯混菌发酵可进一步降低粗纤维、提高酸溶蛋白含量。扫描电镜观察显示发酵后饲料细胞壁结构边界变得模糊，提示底物结构被明显破坏；SDS-PAGE结果表明蛋白质在4 d内由大分子降解为25 kDa以下的小分子肽。营养成分检测显示，SSF提高了粗蛋白、粗纤维和灰分含量，并降低了中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）水平。同时，抗营养因子以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）含量显著下降，说明该工艺不仅改善营养可利用性，还降低了饲料毒性风险。
在“The impact of solid-state fermentation on the microbial community structure of feed”部分，16S rDNA测序揭示SSF显著改变了饲料微生物生态。SSF组α多样性升高，样本间β多样性明显分离，且ASV数量增加。门水平上，蓝细菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）下降，而厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）升高。属水平上，对照组核心菌属为Pseudomonas和Lactobacillus，而SSF组核心菌属集中为Lactobacillus，并伴随Pediococcus等有益菌增加、Streptococcus降低。LEfSe分析进一步鉴定出17个差异富集菌群，功能预测提示氨基酸和核苷酸糖相关代谢通路富集，表明发酵显著重塑了饲料微生态及其潜在代谢功能。
在“The impact of solid-state fermentation on feed flavor metabolites”部分，研究人员利用GC × GC-TOFMS和多变量统计分析评价发酵对饲料风味特征的影响。结果显示，SSF组与对照组挥发性化合物谱明显分离，且SSF组特异化合物更多。发酵后，醛类、酸类、酯类和酚类风味物质相对含量增加；2-辛烯醛和香兰素显著升高，使饲料具有更明显的甜香、果香和青草香特征。与此同时，部分风味物质如下调的乙基十二酸酯、乙基己酸酯等发生变化，说明发酵过程不仅增加风味多样性，也改变了关键感官特征相关代谢网络。
在“Effect of solid-state fermented on apparent digestibility and meat quality”部分，动物饲喂结果表明，SSF日粮显著提高平均日增重（ADG）并降低料重比（FCR），而平均日采食量未见显著变化。血清生化指标显示，白蛋白（ALB）和血糖（GLU）升高，球蛋白（GLOB）和肌酐（Crea）降低。免疫方面，免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）水平升高，炎症因子IL-4和IL-6下降；抗氧化方面，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）升高，丙二醛（MDA）下降。肉品质检测显示，背最长肌剪切力下降，提示嫩度改善。相关网络分析进一步表明，厚壁菌门升高与短链脂肪酸（SCFAs，short-chain fatty acids）相关代谢产物及更优生长表现相关。
在“Effect of solid-state fermented feed on pig intestine”部分，H&E染色表明，SSF组小肠绒毛排列更整齐，空肠绒毛呈更明显叶片状，提示吸收表面积增加。十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度与隐窝深度均显著提高，空肠和十二指肠绒毛/隐窝比值升高，说明小肠组织结构得到改善。同时，空肠中紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达升高，证明SSF日粮增强了肠道屏障功能，有助于维持肠道完整性和营养吸收。
在“Effect of microbial enzyme co - fermentation feed on the muscle transcriptome of growing pigs”部分，研究人员进一步考察了肌肉发育与分子调控效应。结果显示，SSF组肌生成相关基因MYOG、MYOD和MYF5表达显著升高。RNA-seq鉴定出320个差异表达基因，其中123个上调、197个下调，差异基因主要富集于细胞色素P450外源物代谢、药物代谢-细胞色素P450及精氨酸生物合成通路。相关性分析显示，厚壁菌门丰度增加与某些脂肪酸乙酯类代谢物积累相关，并与ADG升高、FCR降低相联系；同时，Firmicutes相关代谢物如2,3-丁二醇和2-壬烯醛与TNF-α、IL-6降低有关，提示其可能参与炎症缓解和生长促进。
讨论部分指出，SSF因其适用菌种广、底物容量大和操作相对简便而具有产业应用潜力，但其效果易受菌种、底物和工艺条件影响，且单纯微生物发酵可能存在酶产量不足、发酵稳定性不高等局限。本研究通过菌酶协同策略，对菌株配比和工艺条件进行了系统优化，证实该策略可促进蛋白降解、降低纤维和抗营养因子、改善毒素水平，并形成以Lactobacillus和Firmicutes增殖为特征的有益微生物群落结构。与此同时，风味代谢物谱发生明显重塑，说明发酵不仅提升营养学价值，也可能提高适口性。动物试验结果进一步从生产性能、免疫抗氧化状态、小肠形态和屏障蛋白表达等层面支持SSF的生物学效益。论文同时指出，当前设计尚不能区分观察到的肠道微生物变化究竟源于发酵饲料中活菌直接定植，还是由代谢产物与微生物共同作用导致；此外，处理组重复栏数较少，因此未来仍需扩大样本量进一步验证。
研究结论部分可译为：本研究成功建立并优化了一种基于枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉组合的固态发酵（SSF）工艺。该工艺通过微生物与酶的协同作用显著提升了饲料营养价值，增加了有益菌群丰度，并改善了风味特征。在生长猪日粮中添加10%发酵饲料后，可有效促进肌肉发育并改善肉品嫩度，提高血清抗氧化与免疫能力，显著改善小肠组织形态并增强肠道屏障功能，从而有利于生长猪的营养吸收与健康生长。
