超越宏基因组学：培养组学(Culturomics)揭示骆驼肠道好氧及兼性厌氧细菌多样性

《Animal Microbiome》：Beyond metagenomics: culturomics uncovers aerobic and facultative anaerobic bacterial diversity in the camel gut

　　

尽管宏基因组学(Metagenomics)改变了研究人员对微生物生态系统的认知，但基于培养的方法对于获取微生物功能特性及生物技术潜力仍不可或缺。本研究采用培养组学(Culturomics)策略，探究采食原始荒漠植被的单峰驼(Camelus dromedarius)胃肠道内可培养好氧及兼性厌氧细菌的多样性、丰度及分布。研究人员使用6种培养基（含改良YCFA配方）共分离获得97个细菌种，分属42个属、31个科及4个门：厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinomycetota)和拟杆菌门(Bacteroidota)。值得注意的是，88.6%的多样性由YCFA基培养基回收，并鉴定出4个候选新种。瘤胃(Rumen)拥有最丰富的以革兰氏阳性菌为主的群落，而小肠则富集含较多潜在致病性的革兰氏阴性菌种。上述发现凸显了骆驼独特的极端干旱环境生理适应性——即在养分与水分受限条件下具备高效纤维降解能力，且存在可抵抗酸及渗透胁迫的应激耐受型肠道微生物。总之，本研究建立了骆驼肠道菌群的基础认知，并强调培养依赖法对宏基因组学的互补价值。未来结合严格厌氧培养及多组学分析将进一步揭示沙漠适应型微生物生命的生态及生物技术潜力。

论文解读：超越宏基因组学——培养组学揭示单峰驼胃肠道可培养好氧及兼性厌氧细菌多样性

《Animal Microbiome》刊载的本研究针对单峰驼(Camelus dromedarius)胃肠道微生物研究长期依赖非培养手段、忽视可培养功能微生物及沙漠适应特异菌株的问题，采用培养组学(Culturomics)策略对瘤胃(Rumen)、瓣胃/真胃(Abomasum)及小肠(Small intestine)可培养好氧与兼性厌氧菌进行系统性分离鉴定。研究发现骆驼肠道可培养菌群沿消化道呈明显分区，YCFA培养基极高效地回收了大部分可培养类群，并发现4株潜在新种，揭示了骆驼作为极端环境宿主拥有独特的应激耐受型可培养微生物库，为反刍动物微生态及微生物资源开发提供活体菌株基础。

主要关键技术方法

研究人员采集伊朗Qom地区3头（1雌2雄，2~5龄）自然放牧单峰驼屠宰后瘤胃、真胃(Abomasum)及小肠内容物与组织，匀浆后经PBS稀释涂布于6种培养基——包括基础YCFA(Yeast extract–Casitone–Fatty acid medium)、添加牛磺胆酸钠的YCFA+S、降葡萄糖添麦芽糖与纤维二糖的YCFA+2 G及YCFA+2GS，辅以营养琼脂(NA)与胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，于37 ℃好氧及含5% CO₂兼性厌氧条件下培养。挑取不同形态单菌落纯化，热裂解法提取基因组DNA，扩增全长16S rRNA基因并Sanger测序，比对EzTaxon数据库以≥98.65%相似度定种。利用MEGA 7.0构建邻接法(Neighbor-joining)系统进化树，R语言vegan包进行α/β多样性分析及主坐标分析(PCoA, Bray–Curtis相异度)，GraphPad Prism及ClustVis绘制热图与Venn图。

研究结果

Diversity of culturable bacteria identified in the gastrointestinal tract（胃肠道可培养细菌多样性识别）

研究人员从三个肠段共分离1105个菌落，鉴定为97种、42属、31科、4门，其中厚壁菌门(Firmicutes, 56.35%)与变形菌门(Proteobacteria, 37.79%)占优。瘤胃和真胃以厚壁菌门为主，小肠变形菌门丰度升高；拟杆菌门(Bacteroidota, 0.22%)仅见于瘤胃，放线菌门(Actinomycetota, 5.64%~8%)分布于瘤胃与真胃。优势科为乳杆菌科(Lactobacillaceae, 14.29%)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)等。革兰氏染色显示瘤胃与真胃革兰氏阳性菌主导，小肠革兰氏阴性菌占优。腔内内容物比组织黏膜面分离更多类群（瘤胃64%、真胃91%、小肠66%），部分菌种（如Enterococcus durans、Lactobacillus sakei）在两微生境共有。

Microbial composition and distribution across the GIT（沿胃肠道的微生物组成与分布）

各肠段菌群具明显区室化特征：瘤胃乳杆菌科(67.55%)主导且家族水平多样性最高；真胃乳杆菌科仍为主力(65.84%)但肠球菌科(Enterococcaceae)与肠杆菌科比例上升；小肠肠杆菌科剧增至92.44%，乳杆菌科降至0.29%，独有Hafniaceae。属水平瘤富乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)等，小肠富集埃希氏菌属(Escherichia)/志贺氏菌属(Shigella)。仅3个种（Lactobacillus sakei、Enterococcus durans、Enterococcus hirae）在三肠段共有。

Culturable bacterial taxa shared across GIT sections（各GIT区段共享的可培养细菌分类单元）

Venn分析显示乳杆菌科、肠球菌科、肠杆菌科三科及乳杆菌属、肠球菌属、志贺氏菌属/埃希氏菌属三属通有三肠段。种水平共享极少，瘤胃—真胃共享7种（含Lactobacillus curvatus、Bacillus altitudinis等），其余区段共享1~4种。PCoA显示三肠段菌群显著分离(p = 0.004)，α多样性(Shannon effective number)瘤胃最高(e^H'=38.84)，真胃(8.72)及小肠(6.79)递减，表明瘤胃是可培养微生物主要储库。

Putative novel species（潜在新种）

4株分离自瘤胃YCFA平板、兼性厌氧条件，16S rRNA与最近模式株相似度均低于98.65%：近似棒状杆菌属(Corynebacterium amycolatum, 97.75%)、Lampropedia hyalina(96.11%)、Microbacterium invictum(97.92%)及Enterococcus hirae(95.80%)，提示其为潜在新分类单元，待全基因组ANI及DDH验证。

Media-specific isolation of bacterial diversity（培养基特异性细菌多样性分离效果）

基础YCFA回收最多(n=701, 涵盖88.6%总物种、全部拟杆菌门及95%变形菌门)，改良版YCFA+S富集胆汁耐受菌，YCFA+2 G/YCFA+2GS分别偏好特定肠球菌与链球菌。YCFA Shannon有效值(20.94)及分类丰富度最高，加糖配方降低均匀度与多样性。PCoA证实不同培养基所获群落显著分离(p = 0.001)。

Complementarity with metagenomics and Reference databases（与宏基因组学及参考数据库的互补性）

与既往骆驼瘤胃宏基因组研究(Gharechahi et al.)无属水平重叠（后者检测严格厌氧菌，本研究获42个好氧/兼性厌氧属），体现方法互补。对比Hungate1000库82个瘤胃菌属仅8.8%重合，27.4%本研究属缺席于该库，再次印证骆驼肠道独特且培养组学填补了参考库空白。

讨论与结论总结

讨论指出瘤胃可培养多样性最高，小肠受低pH及胆盐限制致多样性骤降；骆驼瘤胃拟杆菌门(Bacteroidota)匮乏、厚壁菌门(Firmicutes)偏高不同于普通反刍动物，反映干旱环境宿主特异适应。分离获得的芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)等具纤维降解、耐酸耐胆盐潜能，支持沙漠生境下营养转化与病原菌抑制。YCFA为骆驼肠道可培养菌高效回收培养基。局限含未涵盖严格厌氧菌、样本数偏少及未验证菌株功能，建议后续联用厌氧培养、扩大群体并开展多组学(multi-omics)及表型测定。

结论：单峰驼胃肠道是可培养微生物尤其潜在新种的重要储库，培养组学(Culturomics)有效补充宏基因组学盲点，揭示沙漠适应型可培养好氧及兼性厌氧菌群沿消化道分区分布，为反刍动物微生态学与微生物资源开发奠基。