β-Lapachone诱导的氧化应激引起PARP依赖性的NAD+耗竭并影响原代培养大鼠星形胶质细胞能量代谢

《Neurochemical Research》：β-Lapachone-Induced Oxidative Stress Causes PARP-Dependent NAD+-Depletion that Affects the Energy Metabolism of Cultured Primary Rat Astrocytes

　　

摘要：氧化应激与多种脑病理密切相关。由于脑星形胶质细胞(astrocytes)具有较强的抗氧化潜能，研究人员通过测定细胞氧化还原及能量代谢关键组分的胞内水平，研究了β-Lapachone诱导的氧化应激对培养星形胶质细胞(cell metabolism of cultured astrocytes)代谢的影响。β-Lapachone处理引起胞内NADH和NADPH快速氧化，随后出现时间及浓度依赖性的总细胞NADx（NAD+与NADH总和）含量降低及总细胞NADPx（NADP+与NADPH总和）含量升高，而细胞活力未受影响。此外，处理组细胞ATP部分耗竭，并在呼吸链抑制剂antimycin A处理后丧失上调糖酵解乳酸生成的能力。上述所有效应均可被NQO1(NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase 1)介导β-Lapachone还原的抑制剂ES936所阻断。聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerases, PARPs)抑制剂PJ34或AZD-2461不影响谷胱甘肽二硫化物(glutathione disulfide, GSSG)的显著胞内累积，但显著降低氧化应激诱导的细胞NADx和ATP损失，维持antimycin A孵育期间细胞上调糖酵解乳酸生成的能力，并使细胞NADPx含量的增幅加倍。去除β-Lapachone诱导的氧化应激后，在NAD+前体烟酰胺(nicotinamide)存在下星形胶质细胞可恢复初始细胞NADx含量，此恢复伴随antimycin A暴露期间上调糖酵解乳酸生成能力的重建。研究结果表明氧化应激对星形胶质细胞多项基本代谢参数有严重影响，同时也证明这些细胞在严重氧化应激后具有较高的恢复潜能。

论文解读：β-Lapachone诱导氧化应激通过PARP依赖性NAD⁺耗竭影响原代培养大鼠星形胶质细胞能量代谢

一、研究背景与立项依据

脑内氧化应激与能量代谢异常密切关联于急性神经病理（如创伤性脑损伤、脑卒中）及神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）。脑细胞中三大关键氧化还原对——谷胱甘肽氧化还原对(GSx = GSH + 2×GSSG)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化还原对(NADPx = NADP⁺+ NADPH)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原对(NADx = NAD⁺+ NADH)——对抗氧化防御和电子传递至关重要。星形胶质细胞是神经元重要的代谢伙伴，具备强大的抗氧化与代谢潜能。以往研究表明过氧化氢氧化应激可通过NAD激酶(NAD kinase, NADK)将NAD⁺磷酸化为NADP⁺，引起NADPx升高、NADx降低，但严重氧化应激下PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)激活导致NAD⁺大量消耗及其对星形胶质能量代谢的影响尚未在原代培养大鼠星形胶质细胞中系统阐明。β-Lapachone经NQO1(NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase 1)还原产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，是诱导可控氧化应激的理想模型。本研究旨在探明β-Lapachone诱导氧化应激对三大氧化还原对及能量代谢的影响，明确PARP在NADx耗竭中的作用，并评估星形胶质细胞的代谢恢复能力。该论文发表于《Neurochemical Research》。

二、主要关键技术方法

研究采用新生Wistar大鼠全脑原代培养富星形胶质细胞（培养19–23天，含少量小胶质及少突胶质细胞）。实验用β-Lapachone（≤15 μM，溶于DMSO）在无血清孵育缓冲液(incubation buffer, IB)中含5 mM葡萄糖进行氧化应激诱导，设NQO1抑制剂ES936、戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway, PPP)关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)抑制剂G6PDi-1及PARP抑制剂PJ34或AZD-2461为干预组。细胞经预孵育、洗涤后进行主孵育或恢复阶段孵育（含/不含烟酰胺及含/不含呼吸链复合物III抑制剂antimycin A）。检测指标包括：用酶循环法(cycling assay)测定细胞NADx与NADPx含量（分别用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)+吩嗪甲硫酸(phenazine methosulfate, PMS)及G6PDH+吩嗪乙基硫酸(phenazine ethosulfate, PES)体系）、Tietze酶法测GSx与GSSG、荧光素-荧光素酶法测ATP、偶联酶法测上清乳酸浓度、上清LDH活性反映细胞活力、Lowry法测蛋白定量归一化。数据统计用ANOVA及t检验。

三、研究结果

Effects of β-Lapachone-Induced Oxidative Stress On the Cellular Contents of Nicotinamide Cofactors（β-Lapachone诱导氧化应激对烟酰胺辅因子细胞含量的影响）

低浓度(1–3 μM)β-Lapachone即引起NADH和NADPH完全氧化但不改变NADx/NADPx总量；高浓度(10–15 μM)引起NADx显著降低(~80%)、NADPx升高(~40%)及ATP降至~50%，且细胞GSH大部分氧化为GSSG，但无LDH泄漏（细胞存活）。上述变化被NQO1抑制剂ES936完全阻断，G6PDi-1不改变NADx丢失但增强NADPx积累并防止ATP下降，说明PPP分流耗能参与ATP降低。

PARP-Dependency of the NADx Depletion During β-Lapachone-Induced Oxidative Stress（β-Lapachone诱导氧化应激中NADx耗竭的PARP依赖性）

PARP抑制剂PJ34或AZD-2461使β-Lapachone引起的NADx丢失减少约60%，NADPx增幅加倍，ATP下降显著减轻，但不影响NADH/NADPH完全氧化及GSSG积累，证明NADx大量耗竭主要由氧化DNA损伤激活PARP催化NAD⁺消耗所致，而氧化应激本身及GSH氧化不依赖PARP。

Consequences of PARP-Dependent NADx-Depletion on the Energy Metabolism of Astrocytes（PARP依赖性NADx耗竭对星形胶质细胞能量代谢的影响）

β-Lapachone预处理使细胞后续无法在antimycin A（阻断线粒体氧化磷酸化迫使糖酵解补偿）存在时上调乳酸生成且ATP进一步骤降；若预处理中加入ES936或PARP抑制剂PJ34维持较高NADx池，则antimycin A诱导的糖酵解上调能力和ATP维持均得以保留。表明PARP过度消耗NAD⁺致使糖酵解关键底物NAD⁺不足，直接损害glycolytic flux上调能力。

Restoration of the Initial Cellular Contents of Redox Cofactors and ATP Following β-Lapachone-Induced Oxidative Stress（β-Lapachone诱导氧化应激后氧化还原辅因子及ATP初始细胞含量的恢复）

撤除β-Lapachone后在含血清培养基中孵育，细胞于4小时内恢复~90%初始NADx、2小时内恢复~80% ATP，NADPx在1小时内回落至初始水平附近；在无NAD⁺前体的简单缓冲液中NADx仅恢复至~30%，加入烟酰胺(nicotinamide, 1 mM)后NADx恢复加速并达~80%（4小时），但NAD⁺/NADH与NADP⁺/NADPH氧化还原比恢复需6小时，GSH/GSSG比则在1小时内完全恢复。恢复NADx后的细胞重新获得antimycin A刺激下上调乳酸生成的能力。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出：15 μM β-Lapachone 15分钟处理通过NQO1介导ROS生成→DNA损伤→PARP激活大量消耗NAD⁺，同时氧化应激激活NADK将剩余NAD⁺磷酸化为NADP⁺（致NADPx升高），两酶共同导致NADx池枯竭。NAD⁺匮乏限制糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)反应，使细胞在呼吸链抑制时无法上调糖酵解产乳酸及维持ATP。PPP分流进入氧化分支为NADPH再生以还原GSSG也部分解释ATP轻度下降。星形胶质细胞具强恢复力，撤除应激后在培养液或烟酰胺辅助下可重建NADx与ATP池及代谢功能，唯NAD(P)H再还原较慢。PARP抑制剂可保留足够NADx以维持后续糖酵解代偿能力，提示调控PARP与NAD⁺稳态或为神经保护策略。

研究结论翻译：短时间β-Lapachone诱导氧化应激通过PARP和NADK活化严重耗竭星形胶质细胞NADx并影响能量代谢，但星形胶质细胞具高度恢复潜能，且需NAD⁺前体（如烟酰胺）以实现高效NADx重建；该研究阐明了氧化应激—PARP激活—NAD⁺耗竭—糖酵解受损的级联关系，为理解脑氧化应激下星形胶质代谢失调及恢复机制提供新见解。