RAPGEF6基因的一个新发（de novo）功能缺失（Loss-of-function, LoF）变异支持其在神经精神障碍中的作用

《Journal of Molecular Neuroscience》：A de novo Loss-of-function Variant in RAPGEF6 Supports its Role in Neuropsychiatric Disorders

　　

摘要：RAPGEF6是作用于Rap小GTP酶并含有Ras/Rap结合结构域的鸟苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor, GEF）亚家族成员。尽管该基因缺陷既往与精神分裂症相关，但目前OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）中尚无RAPGEF6对应的特定临床表型条目。本研究对一名表现为精神障碍伴轻度智力障碍（Intellectual Disability, ID）的个体进行核心家系（Trio）全外显子测序（Whole-Exome Sequencing, WES），发现RAPGEF6基因（转录本NM_016340.6）存在新发（de novo）移码变异c.272dup（p.Pro92Serfs*6），依据ACMG（American College of Medical Genetics and Genomics）指南判读为疑似致病（Likely Pathogenic）。虽不能排除WES未检出的其他遗传因素贡献，但BrainSpan数据库发育转录组数据显示RAPGEF6在全生命周期人脑中表达，参与神经元突起发育、Rap蛋白信号转导及GTP酶活性调控；DECIPHER数据库结构变异数据显示涉及RAPGEF6的拷贝数变异（Copy Number Variants, CNVs）主要与智力障碍和小颌畸形相关，且该基因对功能缺失（Loss-of-function, LoF）变异高度不耐受（pLI=1）。NMD-Esc预测器及MutationTaster均提示该移码突变可引发无义介导的mRNA降解（Nonsense-Mediated Decay, NMD），导致蛋白表达缺失。此外，视黄酸诱导SK-N-BE神经母细胞瘤细胞神经元分化过程中RAPGEF6表达逐渐升高，提示其在神经元成熟中的作用。综上，上述数据支持RAPGEF6单倍剂量不足（Haploinsufficiency）参与神经发育及精神表型的形成，强化了其作为神经精神障碍新兴易感基因的地位。

论文解读：《Journal of Molecular Neuroscience》——RAPGEF6新发功能缺失变异支持其在神经精神障碍中的作用

一、研究背景与立项依据

鸟苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor, GEF）及其小GTP酶底物构成调控细胞骨架动态、膜运输及转录调节的基础网络。RAPGEF6（又称PDZ-GEF2同类家族成员）属Rap特异性GEF，含Ras/Rap-associating（RA）结构域及PDZ结合域，与RAPGEF2共同调控大脑皮层神经祖细胞顶面膜黏附连接（Adherens Junctions）的形成及神经元发育。既往关联分析及小鼠模型提示RAPGEF6缺失可致海马及杏仁核功能异常，与精神分裂症（Schizophrenia）样表型相关，且该基因座CNV曾见于智力障碍（Intellectual Disability, ID）患者，但截至目前RAPGEF6尚未被OMIM收录为明确疾病致病基因，也缺乏新发（de novo）功能缺失（Loss-of-function, LoF）变异与人类神经精神表型直接关联的高证据等级报道。鉴于gnomAD约束指标显示RAPGEF6对LoF变异极度不耐受（pLI=1），研究人员假设该基因的de novo LoF变异可能是神经发育及精神障碍的潜在病因，因此开展本研究以探寻新发致病变异并评估其生物学效应。

二、主要关键技术方法

研究人员收集一名无亲缘关系、表型正常的父母所生、表现为精神病性障碍伴轻度智力障碍的男性先证者及其父母组成核心家系（Trio），提取外周血白细胞基因组DNA，采用Agilent SureSelect V7试剂盒进行全外显子捕获，Illumina HiSeq 3000平台测序（目标区域≥20×覆盖度达97%），以HG38为参考基因组进行比对。变异过滤保留MAF＜1%（gnomAD v4.1、1000 Genomes、ESP6500），按新发、隐性及X连锁模式初筛，使用Franklin by QIAGEN注释及ACMG（2015）标准分类，新发现RAPGEF6候选变异经Sanger测序验证。生物信息学分析包括：DOMINO工具预测遗传模式、MutationTaster及NMDEscPredictor评估无义介导降解（Nonsense-Mediated Decay, NMD）倾向、LoFTEE插件判断LoF置信度、DECIPHER查CNV及表型、BrainSpan与BrainRNAseq查脑发育表达谱、Denovo-db及GWAS Catalog检索已有关联。体外实验采用SK-N-BE神经母细胞瘤细胞，10 μM 全反式视黄酸（Retinoic Acid, RA）诱导神经元分化，于第0、3、6、9、12天收集样本，提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR）检测RAPGEF6相对表达量（内参ACTB），2^?ΔΔCt法计算，GraphPad Prism行统计学分析。

三、研究结果

Clinical Report（临床报告）

先证者为12岁男性，出生时有围生期窒息史，运动及语言发育全面迟缓（独立行走及单词约24月龄），幼儿期有多次热性惊厥及一次无热惊厥，脑MRI、脑电图及代谢筛查未见异常，染色体微阵列分析（array CGH）未见致病性CNV。早期表现为多动、冲动、对立违抗及攻击行为，随病程出现思维及感知觉障碍（幻听、幻视），认知水平由边缘降至轻度智力障碍（Mild ID），诊断为伴轻度智力障碍的精神病性障碍，对抗精神病药部分反应。此临床特征提示存在神经发育异常背景。

Identification of a de novo Frameshift Variant in RAPGEF6（RAPGEF6中新发移码变异的鉴定）

Trio-WES筛选出RAPGEF6（NM_016340.6）第272位核苷酸腺嘌呤重复插入c.272dup，导致第92位脯氨酸编码框移并提前终止p.(Pro92Serfs*6)，为典型早期截短变异。该变异在先证者为杂合、父母均未检出，证实为新发（de novo）。gnomAD中频率为0，PhyloP100=6.96提示位点保守，MutationTaster预测为有害，NMDEscPredictor及LoFTEE提示将触发NMD，致蛋白不表达（单倍剂量不足/Haploinsufficiency）。ACMG评级依据PS2（新发）+PM2（人群频率极低）=疑似致病（Likely Pathogenic）。DOMINO评分0.406（介于常隐0与常显1之间）提示尚无法严格界定显/隐性模式。同批还检出父源BRCA2致病移码及母源FGFR3错义变异，但与神经精神表型不符。

RAPGEF6 Expression During Neuronal Differentiation（神经元分化过程中RAPGEF6的表达）

RA诱导SK-N-BE细胞分化过程中，细胞逐渐伸出长突起呈神经元样形态。qRT-PCR显示RAPGEF6 mRNA水平随分化天数进行性上调，第6、9、12天较第0天（增殖期）显著升高（p＜0.01），表明RAPGEF6在神经元成熟及分化相关过程中可能具功能性作用。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出：本例de novo早期移码致NMD是最符合LoF机制的变异，与RAPGEF6高度LoF不耐受（gnomAD o/e LoF=0.32, pLI=1；DECIPHER显示该基因座CNV以缺失为主且多见于ID）相符，支持单倍剂量不足假说。虽然RAPGEF6未被OMIM收录、ClinVar无此变异记录，且个别已报错义/VUS及CNV难以单独归因，但结合小鼠Rapgef6-KO表现（海马/杏仁核功能受损→过度活动、工作记忆缺陷等类精神分裂样行为）及本例新发LoF+神经精神表型+脑发育高表达+分化上调等证据链，强化了RAPGEF6作为神经发育及精神障碍易感基因的生物可信度。作者亦承认本研究缺患者来源淋巴母细胞NMD验证及蛋白功能实验之局限。

结论（翻译）：

在本研究中，研究人员调查了一名出生于未患病父母、表现为精神障碍及轻度智力障碍的男性个体。核心家系全外显子测序鉴定到RAPGEF6基因的新发变异c.272dup p.(Pro92Serfs*6)，该基因既往通过小鼠模型功能研究被认为与精神分裂症及行为异常相关。此变异依据ACMG标准归类为疑似致病（Likely Pathogenic）。计算机分析预测该变异引发无义介导的mRNA降解（NMD），产生与单倍剂量不足（Haploinsufficiency）一致的性功能缺失效应。本研究旨在加强RAPGEF6与精神表型之间的关联。尽管如此，仍需功能学研究验证RAPGEF6基因缺陷的生物学影响并阐明其对相关信号通路的作用。总体而言，本研究结果增强了RAPGEF6参与神经发育及精神表型的生物学合理性，并为未来旨在阐明其在神经元分化及脑功能中作用的功能学研究提供了依据。